实验九重组蛋白的sdspage.ppt

1 样品浓缩效应 (1)凝胶孔径不连续性 (2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 (3)电位梯度的不连续性 (2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性: Tris: 缓冲配对离子，维持溶液的电中性及pH值 Cl-:在电场中迁移率快，前导离子(leading ion) ，快离子。 Gly:其pI =6.0，在pH6.7的浓缩胶缓冲体系中，甘氨酸解离度很小，因而在电场中迁移很慢，称为尾随离子（trailing ion），慢离子。 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质;因此Cl-及NH2CH2COO-沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面,然后再分成多个区带. 大多数蛋白质在pH6.7或8.3时均带负电荷，在电场中，都向正极移动。 (3)电位梯度的不连续性 V(电泳速度)=E(电位梯度) * m(迁移率) E高m慢≈E低m快 由于蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，因此也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的中间层。 2 分子筛效应 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率分子筛效应。 分子量小且为球形的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面;反之，则阻力大，移动慢，走在后面。 分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。 3 电荷效应 进入pH8.9的分离胶中，各种蛋白质所带净电荷不同，而有不同的迁移率。 表面电荷多，则迁移快；反之，则慢 各种蛋白质按电荷多少、分子量及形状，以一定顺序排成一个个条型的区带，从而达到分离的目的。 思考题 在不连续体系SDS中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么? 电极缓冲液中甘氨酸的作用? 在不连续体系SDS中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用? 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟? 3.4 上样与电泳 将电泳槽与电泳仪连接好， 上槽接负极，下槽接正极。 上下槽中加满电极缓冲液， 移液枪或微量注射器加样，每孔20ul。 电泳条件：开始电压90V,待样品进入分离胶时，恒压130V，电泳约2.0h,直至前沿距下端约0.2cm。 加样： 标准蛋白（marker）：5ul, E.Coli lysis：20ul Purified protein: 20ul(0.5mg/ml) 注意：电泳样品加入样品处理液后，要在沸水浴中煮3～5 min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。 标准蛋白（marker）：5ul E.Coli lysis：20ul Purified protein: 20ul(0.5mg/ml) Purified protein: 20ul(0.5mg/ml) Spr1479 E.Coli lysis：20ul 上清 预染标准蛋白（marker）：5ul 8 7 6 5 4 3 2 1 3.5 凝胶板剥离与固定 电泳结束后，关闭电泳仪。用不锈钢药铲撬开玻璃板，取出胶膜。 4.7 染色与脱色 加入染色液，室温下染色1h，或60℃ 水浴染色10min。100 ℃ 2min, 然后用脱色液脱色，更换脱色液3-4次，直至背景无色为止。 考马斯亮兰R250检测灵敏度可达1ug. 4.1电泳迁移率的计算　 4.2 标准曲线的制作 以各标准蛋白的相对迁移率为横坐标，分子量的对数为纵坐标绘制标准曲线。 4.3 待测蛋白质分子量的计算 根据待测蛋白质的相对迁移率，可以直接从标准曲线上查出该蛋白质的分子量。 4.实验结果处理 * * 实验九 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳　　　　　　法测定蛋白质的分子量 李卫芳 张钧玮 1 实验目的 1.1 通过本实验学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的基本原理。 1.2 初步掌握应用此法测定蛋白质分子量的操作技术。 纸电泳 琼脂糖电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 毛细管电泳 NativeSDSIEF2DClassification 2 实验原理 SDS－PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）， 1967年由Shapiro等建立 1969年由Weber和Osborn进一步完善 用于测蛋白质亚基分子量 聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及有关特性 聚合反应 聚丙烯酰胺是由单体(Acr)、交联剂(Bis)，在催化剂(AP或核黄素) 和加速剂(TEMED)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。 ①丙烯酰胺（Acr）：是凝胶的最主要成分，单体聚合形成长链。 ②甲叉双丙烯酰胺(Bis)：是交联剂，将聚丙烯酰胺链交联成三维网状结构。 ③过硫酸铵(AP)