第八章基因文库与克隆分析应用.ppt

四、PCR技术及其应用 PCR的概念 PCR技术的创建 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用 （1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100?L反应体系。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 （2）引物浓度 10-20 pmol/20?L反应体系 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-1.0 U/50?L反应体系 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 引物设计： （1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以20-40个碱基为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基，最好不能为A；5’端无严格限制,可引入酶切位点。 PCR技术的创建 Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 。 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 生物样品 基因诊断 基因治疗 基因工程产品 法医学检测 人类学研究 …… DNA片段 PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要 94℃变性 50-65℃退火 72℃延伸 PCR原理 94℃ 55℃ 72℃ PCR循环 PCR原理 总体积 25-50-100 ?l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 反应体系 PCR原理 PCR原理 Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 温度(℃) 酶活性(%) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 PCR原理 PCR原理 * 第八章 基因文库与克隆分析应用 一、复习 二、目的基因的获得 三、外源基因的表达系统 四、PCR技术及其应用 复习 DNA重组技术基本步骤 ?目的基因的提取:供体生物基因或称外源基因的 提取 ?限制性酶切：目的基因切成不同大小的片段 ?酶接（连接）：连接到另一DNA分子上（克隆载体） ?转化:将这个重组DNA分子转入受体细胞 ?筛选和鉴定:对吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定 ?基因表达：进行培养，检测外援基因是否表达。 1、质粒载体 2、噬菌体载体 3、考斯质粒（粘性质粒，cosmid） 理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求： ①能在宿主细胞中自主复制。 ②容易进入宿主细胞。 ③容易插入外来核酸片段。 ④容易从宿主细胞中分离纯化， 便于重组操作。 ⑤容易被识别筛选。 复习 质粒的生物学基本特性： 自主复制性：携带有自己的复制起始区（ori），它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。 不相容性：不同质粒如果被导入同一细胞中，会彼此竞争，拷贝数多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中。 稳定性：质粒在宿主细胞中保持着一定的考贝数 寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制 表现型：不同的质粒有不同的表型，如对抗生素的抗性等。 复习 ? 复制类型 质粒在细胞内的复制是受到一定控制的，按其所受控制的程度可分为两类：严紧型和松弛型。 严紧型质粒的复制受到严格的控制，每个细胞中的数量只有1～2个，它们似乎与染色体的复制受相同因素的控制，在一定的细胞周期内复制；染色体不复制时，质粒也不复制。 松弛型质粒的复制不受严格的控制，在整个细胞生长周期中可以随时复制。当用药物抑制了染色体的复制后，它们可以照样复制，显示出与染色体复制受不同因素的控制，因此它们在细胞中可以有较多的数量，一般可达10余个甚至更多，如ColE1质粒。 质粒复制控制的类型，有时