第四章liu4细胞融合.ppt

融合过程中两个细胞膜的变化过程 首先是两个亲本细胞并列，细胞膜相接触。 类脂质分子发生扰动和重排导致细胞桥的形成。 细胞质、核相互融合。 出现膜成分和胞质成分的交流，以及细胞内电导率的连续性。 灭活后的病毒颗粒结合到细胞表面。两受体细胞开始凝聚。 两细胞的膜紧密结合。病毒被膜与受体细胞的浆膜融合。病毒颗粒周围的膜脱离整个膜，产生破口，在两细胞间形成细胞质通道（37℃、1-2min），通道继续扩大，病毒颗粒流入细胞质内，细胞质互相融合。 融合细胞变圆，融合结束。 基于酶缺陷型细胞的杂种筛选 基于药物抗性所建立的杂种筛选 3. 基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选 4. 由温度敏感突变型细胞组成的杂种细胞的筛选 5. 具有所需性状的杂种细胞的筛选 融合细胞的筛选的常用方法 1. HAT选择系统－－基于酶缺陷型细胞杂种筛选 HAT是含一定浓度次黄嘌呤（Hypoxanthine,H）、氨基喋呤（ Aminopterin，A ）及胸腺嘧啶核苷（Thymidine，T）的一种选择性培养基，三种成分与细胞DNA合成有关。 DNA合成途径有两种: 需两种酶：胸腺嘧啶核苷激酶TK酶: （催化胸腺嘧啶核苷产生脱氧胸苷酸） 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶HGPRT酶: （催化次黄嘌呤产生肌苷酸） 主要途径由氨基酸和其他小分子化合物合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸是必不可少的媒介，参与嘌呤环和嘧啶甲基合成，氨基蝶呤抑制二氢叶酸还原酶活性，阻断FH2到FH4合成。 基于HAT培养基的筛选系统 H（Hypoxanthine次黄嘌呤）应急途径中所提供之外源核苷 酸前体 A（Aminopterin，氨基喋呤）阻断核苷酸的从头合成 T（Thymidine，胸腺嘧啶）应急途径中所提供之外源核苷酸前体 HGPRT/TK酶缺陷型细胞株（长期培养系） 不能在HAT培养液中生长 正常细胞 体外生存能力有限，最终也将死亡 融合细胞 最后，只有融合细胞在HAT培养液中存活 2. 利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。 亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不敏感 亲本B：对卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感 杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长 3.营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。 亲本A：色氨酸缺陷型 亲本B：苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。 4.温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在37度范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。 亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。 亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡那霉素。 杂种细胞能在高温和含卡那霉素的培养基上生长。 （三）融合细胞的克隆化 克隆化的目的就是利用单个细胞培养的技术选育出遗传稳定的、能表达特定性状的细胞系。 其主要方法有： 有限稀释法、半固体培养基法、显微操作法、荧光激活分选法。 * * 第四章 细胞融合 一、细胞融合的发现和发展 二、细胞融合的概念 三、自发融合现象 四、细胞融合技术的意义 五、细胞融合的过程 六、诱导融合 七、体细胞杂种的遗传 八、展望 一、细胞融合的发现和发展 1938年，Muller首次发现了体细胞间的融合现象——脊椎动物肿瘤细胞的多核现象。其后科学家们相继在肺结核，天花，水痘，麻疹等疾病患者的病理组织中观察到多核细胞。 　 在细胞体外培养技术出现后，Lambert 首次报道体外培养的肿瘤细胞有10-6 ～ 10-2 自发融合概率。　 1960年，法国的Barski等首先发现，两种不同类型的细胞在混合培养的过程中会自发融合形成融合细胞。 1962年日本学者Okada发现一种日本血细胞凝集病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。在此基础上，用灭活的仙台病毒诱导产生了第一个种间的杂交细胞。 以后人工诱导体细胞融合逐渐成为一门技术发展起来，建立了更有效的融合和选择杂交细胞的方法。广泛应用于种间、属间、科间，乃至动植物细胞间的融合，从而发展成为一门无论在生物学的基础理论研究，或在医学、生物工程的应用研究方面均具广阔前景的细胞工程技术。 二 、细胞融合（cell fusion）的概念 广义：是两个或更多细胞通过 融合形成单个细胞的过 程。 经典：又称体细胞杂交，或细 胞杂交，是指在离体条 件下用人工方法将不同 生物或同种生物不同类 型的单细胞通过无性方