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第二章 生物药物分析与检验常用的方法 第一节 酶法第二节 电泳法第三节 理化法第四节 生物检定法 第一节 酶法 酶法包括两种类型：酶活力测定法和酶分析法。 酶活力测定法是以酶为分析对象的研究，测定样品中某种酶的含量或活性。 酶分析法是以酶为分析工具或分析试剂，测定样品中酶以外的其他物质的含量。 两者检验对象不同 原理和方法相同：以酶专一而高效催化某化学反应为基础，通过对酶促反应速度的测定或对生成物等浓度的测定而检验相应物质的含量。 一、酶活力测定法 （一）酶活力 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。 酶活力的测定实际上是测定一个被酶所催化的化学反应的速度。 酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示。 酶反应的速度愈快表示酶活力愈高。 （二）酶的活力单位和比活力 1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。 　　 酶活力单位：用来表示酶活力大小的单位，通常用酶量来表示。 　　 其中一个称酶活力国际单位，规定为：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个国际单位（IU，又称U）。 　　 另外一个国际酶学会议规定的酶活力单位是Kat，规定为：在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。 　　Kat和U的换算关系： 1 Kat=6×107U， 1U=16.67n Kat 酶的比活力（specific activity）：是指每毫克质量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力。是用来度量酶纯度的指标。是生产和酶学研究中经常使用的基本数据。 比活力越大，酶的纯度越高。 酶在酶制剂中的有效含量可以用每克酶蛋白或每毫升酶蛋白含有多少酶单位来表示（U/g或U/mL） 固体酶比活力=活力（U）/蛋白（mg） =总活力（U）/总蛋白（mg） 酶的转化数(Kcat)：在单位时间内每一活性中心或每分子酶所能转换的底物分子数。生产中并不常用。 （三）酶活力的测定方法 常规测定酶活力的步骤： 1、酶液的稀释 酶制剂是粉剂，要溶解和稀释；液体酶制剂也要稀释。从测定要求来分析，要求底物浓度要远大于酶的浓度。初测时，最佳稀释倍数只能通过试验来确定 2、选择底物浓度 根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配置成一定浓度的底物溶液。要求所用的底物均匀一致，达到一定的纯度。有的底物溶液要求新鲜配置，有的则可预先配置后置于冰箱中保存备用。 3、确定酶促反应的最适条件 根据资料或试验结果，确定酶促反应的最适条件，最适条件包括温度、pH、底物浓度、适宜的离子强度、适当稀释的酶液及严格的反应时间，不允许抑制剂存在，辅助因子不可缺少。 4、反应计时必须准确 反应体系必须预热至规定温度后，加入酶液，搅拌均匀，并立即计时；达到反应时间后，要立即灭除酶活性，终止反应，并记录终止时间。 终止酶反应的方法很多，常用的有：加热使酶失活；加入酶变性剂；加入酸或碱溶液，使pH远离最适pH；降低温度。 5、反应量的测定 测底物减少量或产物生成量均可。酶促反应所用底物的浓度一般都很高，少量底物的消失不易测准；而产物则是从无到有，变化明显，测定较为灵敏准确，所以大都测定产物的生成量。 酶活力测定常用的具体方法有化学分析法、滴定法、比色法、吸收光谱法、荧光法、电化学法和量气法等。 二、酶分析法 酶分析法是一种以酶为分析工具（或试剂）的分析方法。分析对象可以是酶的底物、辅酶活化剂，甚至酶的抑制剂。 在进行这类分析时，先要根据分析对象选择适宜的“工具酶”，然后再通过酶反应的测定，并借助相应的校正曲线来测定他们的浓度或含量。 1、动力学分析法 原理是通过条件控制，分别使底物、辅酶活化剂或抑制剂的浓度在酶反应中起决定反应速度的主导作用，这时酶反应速度和上述相应因素的浓度间将具有确定的比例关系，这样测定酶反应的速度就可求出它们的浓度。 酶分析法采用的条件和酶活力测定法的条件基本相同，但其所用的酶量必须恒定，被测物以外的其他反应成分均须保证处于恒定和最适。 酶分析法必须制备一条酶反应速度相对于相应的被测物浓度的标准曲线，以便对未知样品的量进行检验。 在测定未知样品时，所采用的反应、测定系统和制