第2章第二节微生物制药工艺技术基础.pptVIP

第二节微生物制药工艺技术基础 微生物制药 以发酵工程技术为基础、利用微生物代谢过程生产药物的制备技术。 生产的药物：抗生素、酶抑制剂、免疫调节剂、维生素、氨基酸、核苷酸等。 主要内容：菌种的选育、发酵工艺、发酵产物的提炼及质量控制等。 一、制药微生物菌种的选育与保藏 ㈠菌种的分离 ⑴含菌样品的收集 ⑵富集培养 ⑶菌种的纯化 ㈡制药微生物菌种的选育 1、自然选育 常用的自然选育的方法是单菌落分离法。 自然选育目前主要用于纯化菌种、选育高产 菌株和复壮生产菌株。 2、诱变育种 凡是利用诱变剂处理分散而均匀的微生物群体，促进其基因发生突变的育种技术就称为诱变育种。 常用的诱变剂有紫外线、射线、超声波、脱氨剂、烷化剂、碱基类似物等。 诱变育种过程包括出发菌株的选择、诱变处理和筛选三个部分 ⑴出发菌株的选择 ①出发菌株的稳定性； ②选用具备某种优良特性的菌株； ③挑选对诱变剂敏感的菌株； ④菌种的生理状态及生长发育时间 ⑵诱变处理 能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂。 物理诱变剂：紫外线、射线、超声波、激光 生物诱变剂：噬菌体可作为诱变剂应用于抗噬菌体菌种的选育。 化学诱变：是能和DNA起作用，改变其结构，并引起遗传变异的化学物质。①烷化剂：与DNA的碱基起反应，引起碱基配对的转换而发生遗传变异，如氮介、亚硝酸等；②碱基类似物：掺入到DNA分子中导致遗传变异，如5-氟尿嘧啶；③移码诱变剂：插入DNA双螺旋的临近碱基对之间造成碱基的插入或缺失导致转录或翻译的移码突变，如吖啶黄、吖啶橙等。 诱变剂量的选择：能够提高正变株获得率的诱变剂量为最适剂量。任何诱变剂都有杀菌和诱变两方面的作用，诱变处理后的细胞死亡率越高，活下来的细胞突变率也就越高，故可用死亡率做相对剂量。 增变剂的使用：氯化锂本身并无诱变作用，但在抗生素产生菌的诱变育种中表明氯化锂与一些诱变因子具有协同作用。 ⑶突变株的筛选 ①随机筛选：菌种经诱变处理后，凭经验随机选择一定数量的菌落。 ②半理性化筛选：根据已知的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来设计筛选方法，以打破微生物原有的代谢机制，获得大量形成产物的高产突变菌。 3、现代菌种选育技术 ⑴杂交育种 是将两个基因型不同的菌种经接合使遗传物质重新组合，从中分离和筛选出具有新性状的菌株的过程。 ⑵原生质体融合 用脱壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，再用聚乙二醇促进原生质体发生融合，从而获得融合子。 原生质体融合的重组频率高于普通杂交方法，实现了种间、属间的融合，为亲缘关系较远的、性能差别较大的菌株实现杂交开辟了一条新途径。 ⑶基因工程技术育种 是将某一供体的遗传信息在体外经人工与载体相接，构成重组DNA分子，然后转入受体细胞中，使外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传。基因工程是在分子生物学理论指导下的一种自觉的、能像工程一样可事先设计和控制的育种技术。 ㈢制药微生物菌种的保藏 菌种的退化与防止 退化意味着随时间的推移菌种的一个或多个特性逐步减退或消失，最终导致营养细胞的死亡。 防止措施：①防止基因突变；②采用双重缺陷型；③制定科学管理制度；④分离单菌落；⑤选择培养条件 ⒈斜面低温保藏法 将菌种接种在固体斜面培养基上，待菌充分生长后，移至2-8℃冰箱中保藏。微生物种类不同，保存时间不同 优点：操作简单，使用方便 缺点：保存时间短，容易发生变异 ⒉液体石蜡保藏法 斜面菌种，加入灭菌的液体石蜡，使菌种与空气隔绝。 优点：制作简单，不需特殊设备，不需经常移种 缺点：必须直立放置，需要位置大，不便携带 ⒊沙土管保藏法 按一份黄土三份沙的比例混合均匀，装入小试管中，灭菌烘干备用；将优良菌种制成孢子悬液；在沙土管中加入孢子悬液；将沙土管放入真空干燥器内，用真空泵抽干。 在抗生素工业生产中应用广泛，但应用营养细胞效果不佳 ⒋液氮冷冻保藏法 将菌种制成菌悬液密封于瓶内，冻结后置于液氮中或超低温冰箱中保藏。 防止菌种退化的一个最好的方法。 对其他方法难以保存的支原体、衣原体、霉菌、动物细胞等均可长期保存。 缺点：需特殊设备 ⒌冷冻干燥保藏法 将菌种制成菌悬液，快速冷冻，真空干燥，低温避光保存。 适用于菌种长期保存 缺点：设备和操作都复杂 菌种保藏的注意事项 ①整个保存处理过程中要防止杂菌污染，并一定要做无菌检查； ②保藏所用的菌种要在新鲜的斜面上生长丰满，生长时间不宜过长； ③保藏过程中要防止菌种退化现象的发生，要及时采用有效方法复壮，传代次数过多容易退化； ④菌种制备过程是保持菌种优良特性的一个重要环节。 二、微生物代谢产物的生物合成 ㈠微生物初级代谢产物的生物合成 ㈡微生物次级代谢产物的生物合成 ⒈微生物合成次级代谢产物的基本特征 ⒉次级代谢产物的生源 ⒊次级代谢产物生物合成的基本途径 三、微生