6第六章 基因和载体连接.ppt

* * 第六章 基因与载体连接 一、黏性末端与平末端的连接 二、其他连接方法 一、黏性末端与平末端的连接 一）黏性末端DNA分子间的连接 DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。 1. 两段DNA的连接 依靠粘性末端 依靠粘性末端 2. DNA片断与载体的连接 nick ligase 3. 4 . 粘性末端的更换 在DNA片段上某一酶切口处换成另一种酶切口 二) 平末端（blunt end）的连接 5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。 1. 直接连接 T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ -OH -OH -P -P P- P- HO- HO- 5’ 3’ -OH -P P- HO- 5’ 3’ 1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。 （1）同聚物加尾 法 2. 人工加尾形成 “粘性末端” DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。 ①原理： 分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。 ②加尾—碱基互补 ④缺点： ③优点： 能把任何片段连接起来 不能把插入片段再切下来。 非酶切位点 5‘突出的末端 　 外源片段先用Klenow补平；然后用TdT补加polyC；载体片段也用Klenow补平，加polyG，退火不经连接即可转化。目的是：不使酶切位点遭受破坏。 　 5 ‘ 3 ‘ 3‘ 5 ‘ 5 ‘ 3 ‘ 3 ‘ 5 ‘ 外源基因 载体 TdT ployC TdT ployG Klenow补3‘平端 5 ‘ 5 ‘ 5 ‘ 5 ‘ CCCCC CCCCC GGGGG GGGGG 退火 用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。 （2）衔接物(linker)连接 ① linker 用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。 GGAATTCC CCTTAAGG EcoRI linker： ② linker的作用 ④缺点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段 2）能给载体连接上Polylinker: ③优点： （3）DNA接头 (adapter)连接法 1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。 5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p 5’ BamH I adapter 用T4 DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。 ① adapter 一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。 ② adapter的作用 Blunt-ended DNA 5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’ BamH I adapter P- -P 5‘p-GATCCCGG- GGCC- -CCGG -GGCCCTAG-P5’ 5‘p-GATCCCGG- GGCC- CCGG GGCCCTAG-P5’ CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5’ 接头自我连接 接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。 ③优点： 连上后就能用。 ④缺点： 先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。） ⑤防止自我连接 5‘p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5’ CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5’ 接头之间不能形成磷酸二酯键的自我连接！ 5‘GATCCCGG-OH HO-GGCC5’ 5’CCGG-OH HO-GGCCCTAG5’ CIP处理 -OH HO- Blunt-ended DNA 5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’ BamH I adapter P- -P 5‘GATCCCGG- HO-GGCC CCGG-OH -GGCCCTAG5’ 5’GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC5’ 缺口 缺口 HO- -OH CIP处理 T4 ligase 虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。 一