第二章原核生物分子克隆的宿主和载体系统.ppt

MCS 将外源片段与载体用相同的内切酶处理后，连接，形成重组分子，构建表达载体 1、如何构建载体？ * 2、原核表达载体pET系统能够表达外源基因的原理 （a）分别利用 T7 RNA聚合酶转录目标基因，用大肠杆菌自身的系统翻译合成目标蛋白质。 （b）需要大肠杆菌能表达T7 RNA聚合酶 （c）加入诱导物（IPTG，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 ）同时开启T7 RNA聚合酶和目标基因的表达。 （d）对SD序列与AUG之间的距离进行了优化 * lac O T7 gene 1 lac promoter E.Coli, RNA 聚合酶 lac I gene lac I repressor IPTG 诱导 Host cell T7 RNA 聚合酶 lac O T7 promoter target gene lac I gene lac I repressor pET T7 RNA polimerase IPTG induction 克隆到pET载体中的基因表达调控策略 * lac O T7 gene 1 lac promoter E.Coli, RNA polimerase lac I gene lac I repressor IPTG induction Host cell T7 RNA polimerase lac O T7 promoter target gene lac I gene lac I repressor pET T7 RNA polimerase IPTG induction pLysS Or E T7 lysozme gene T7 lysozme inactive 克隆到pET载体中的基因表达调控策略-----控制T7 RNA聚合酶本底表达 * lac O T7 gene 1 lac promoter E.Coli, RNA polimerase lac I gene lac I repressor IPTG induction Host cell T7 RNA polimerase lac O T7 promoter target gene lac I gene lac I repressor pET T7 RNA polimerase IPTG induction pLysS Or E T7 lysozme gene T7 lysozme inactive 克隆到pET载体中的基因表达调控策略-----控制T7 RNA聚合酶本底表达 * (1) (2) (3) A B Sample Washing Elution X B Ligand containing Ni X B A A 诱导融合蛋白表达后，用裂解液将细菌裂解，释放蛋白。 将裂解液过一个镍柱 将污染的蛋白洗涤后，将目标蛋白洗脱 * * * * 1、对野生λ噬菌体的改进 A、 删除多余的限制性内切酶的位点。 B 、切除一些非必需序列，增加载体的容量。 C、设计阳性选择重组子的方法。 D、设计可方便地通过转录作用制备外源插入DNA的RNA探针的载体 E、发展可以使插入的真核cDNA与β－半乳糖苷酶形成融合蛋白的载体。 二、基于λ噬菌体的克隆载体 * 2、λ噬菌体基因组可删除的部分不影响生存能力 λ噬菌体基因组中可以删除的序列与噬菌体进入从裂解状态进入溶源状态以及从溶源状态进入裂解状态有关，即与噬菌体整合和脱离大肠杆菌的染色体相关 删除了这部分序列的噬菌体只能进行裂解循环 二、基于λ噬菌体的克隆载体 * 3、λ噬菌体载体可分为 插入型载体：只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。 失去了非必需区 切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选 可插入长度为10kb的外源DNA 二、基于λ噬菌体的克隆载体 * 两种报告基因的插入型载体 cI基因内保留HindIII和EcoRI单酶切位点，当有外源DNA在这酶切位点插入时，使cI基因失活，感染hfⅠ-大肠杆菌后可形成空斑（ 如λgt10） 。 在噬菌体DNA插入的lacZ基因末端设有单一的EcoRⅠ酶切位点。在此处插入外源基因，可表达β-半乳糖苷酶的融合蛋白，利用特异性抗体或DNA测序方法可筛选重组DNA。这类载体适宜构建cDNA文库(如λZAPII) 二、基于λ噬菌体的克隆载体 * 替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λ DNA区段可以被外源插入的DNA所取代。 可克隆的片段大，最大可达23kb，而质粒最大仅10 kb左右； λDNA的长度大于野生型λ噬菌体DNA长度的75％而不超过其105％时，才能被包装成噬菌体颗粒，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时，噬菌体的