完整叶绿体的分离.doc

完整叶绿体的分离 目的：了解梯度分离细胞成分的原理 掌握Percoll梯度法从植物叶中分离完整叶绿体的方法 原理： 梯度离心法是根据被分离样品的密度差异，在一定密度梯度介质中加以离心力场，使得不同密度的颗粒悬浮停留在相应的介质区。 植物细胞被细胞壁所包围，因此实验中必须破碎细胞壁的同时保持叶绿体的完整。从破碎细胞中释放出来的叶绿体等质体可经适当的梯度离心，将完整的叶绿体和破碎的叶绿体分开。 植物细胞的质体中储存的淀粉致密颗粒可能在离心过程中造成质体破裂，因此可在较低温度下预处理植物1~2d，以消除淀粉的积累作用。 用Percoll（聚乙烯吡咯烷酮包被的硅颗粒）梯度进行叶绿体的分级分离，与蔗糖相比，Percoll基本上不在梯度内产生渗透压，粘性也较蔗糖低，因而能缩短离心时间。成分中的聚乙二醇可能对破碎了的叶绿体以及过氧化物酶体的条带密度造成影响，因而可以减少此类破碎细胞器对完整叶绿体的污染程度。PEG、Ficoll和BSA有利于维持叶绿体的生物活性。叶绿体经Percoll分级分离后比较稳定，可在冰上保持数小时。叶绿体得率可通过检测叶绿素含量来确定。 实验仪器、材料和试剂 仪器、用具：玻璃匀浆器，高速冷冻离心机，大容量离心管和微量离心管，可见分光光度计，尼龙网，移液器，研钵（用于液氮），石英砂 材料：新鲜菠菜叶或白菜叶 试剂 匀浆悬浮缓冲液： 2mmol/L EDTA(PH8.0) 1mmol/L MgCl2 1mmol/L MnCl2 50mmol/L HEPES-KOH(PH8.0) 0.33mol/L 山梨醇 0.5g/L BSA(无脂肪酸) 5mmol/L 抗坏血酸钠（使用前添加） 50% PBF-percoll梯度： 2mmol/L EDTA(PH8.0) 1mmol/L MgCl2 1mmol/L MnCl2 50mmol/L HEPES-KOH(pH8.0) 0.33mol/L 山梨醇 50% Percoll (V/V) 3% PEG 6000(m/V) 1%BSA (无脂肪酸)（m/V） 1% Ficoll (m/V) 1×SH: 50mmol/L HEPES-KOH 0.33mmol/L 山梨醇 丙酮 方法与步骤 叶绿体的制备 梯度的制备：按照试剂2的配方制备50% PBF-Percoll 梯度，在每个50ml离心管中加入25ml的PBF-Percoll溶液。 29000g离心15min，即可形成梯度。（制成的梯度可于4。C过夜存放） 材料的准备：菠菜叶或白菜叶可直接购买 匀浆：取50～100g左右的叶组织，研钵中加液氮，迅速研磨几下（为增加研磨的强度可添加少量的石英砂），转入预冷的匀浆缓冲液匀浆，避免过度匀浆及产生泡沫。 匀浆液用粗孔尼龙布过滤后，在大容量离心管或离心瓶中2600g，4。C离心5min收集沉淀。 用2ml匀浆缓冲液重悬沉淀（可使用软毛刷轻轻将管壁上的沉淀刷松），小心的加到做好的Percoll梯度上。10500g，4。C离心10min（应见到两条绿色带上方的为破碎叶绿体，接近底部的是完整叶绿体带） 检测叶绿素的含量 （1）5ul叶绿体悬液与995ul的80%丙酮在微量离心管中混匀。 （2）13000g，室温离心2min。 （3）取溶液在663nm及645nm处检测吸光值。 （4）计算：叶绿素含量（mg/ml）=（8.02A663+20.2A645）/5 注意事项 植物细胞由细胞壁包围，因此分离叶绿体破碎细胞壁同时不破坏叶绿体的完整。因此采用液氮研磨加匀浆的方案（研磨时加入石英砂是为了增加机械切力）。注意研磨匀浆过度。 菠菜的质体较小，而且都能在不积累淀粉和酶类物质的条件下生长。菠菜的叶绿体/湿重比率较高。 对于那些叶绿体较大而且形状不规则，或包埋在侯纤维组织中的细胞，可先酶解细胞壁，再破裂原生质体。 使用的牛血清蛋白（BSA）不能含有脂肪酸，以防止脂肪酸氧化造成膜溶解。