第五章 生物制品制造工艺3.ppt

优点： 1)、反向末端重复序列中没有转录调控元件，减少激活原癌基因的可能性 2）、宿主广，只能形成慢性感染 3）、可发生位点特异性整合，有利于表达 4）、热稳定性好，而作为辅助病毒的腺病毒在60℃即被灭活 5）、安全性较好，本身不致病 4、单纯疱疹病毒（herpes simple virus，HSV） 双链DNA病毒，基因组大小152kb，可缺失多个基因仍保持复制能力。 特点： 1）、序列清楚 2）、可容纳至少30kb外源基因 3）、宿主广，可侵染脊椎动物各种细胞 4）、重组病毒培养过程中易得到较高滴度 5）、从外周进入神经系统，不影响神经元功能 但表达产物对多种类型宿主有毒性，且可引起严重免疫反应，要进入临床仍需改进 5、 痘病毒载体 痘苗病毒为线形双链的有包膜病毒, 其核心颗粒不依赖宿主细胞而独立引进转录和复制,宿主范围广泛，易于培养；痘苗病毒基因组中大量非必需基因的缺乏并不影响其在宿主细胞的复制能力,可允许在同一或不同非必需区插入多个基因 痘苗病毒缺点是载体对细胞的毒性,同时病毒能被人体的补体系统灭活并降解 表 常用病毒载体得特征和适用范围 病毒载体 生物学特性 适用范围 反转录病毒载体 可感染分裂细胞； 整合到染色体中 表达时间长 有致癌的危险 Ex vivo基因治疗 肿瘤基因治疗 腺病毒载体 可感染分裂和非分裂细胞 不整合到染色体中 外源基因表达水平高 表达时间较短 免疫原性强 In vivo基因治疗 肿瘤基因治疗 疫苗 AAV病毒载体 可感染分裂和非分裂细胞 整合到染色体中 无致病性；免疫原性弱； 可长期表达外源基因 在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组织中表达水平较高 In vivo 基因治疗 Ex vivo基因治疗 遗传疾病的治疗 获得性慢性疾病的基因治疗 HSV病毒载体 具嗜神经性，可逆轴突传递 可潜伏感染，容量大 可感染分裂和非分裂细胞 神经系统疾病的基因治疗 肿瘤的基因治疗 四、靶细胞 1、造血细胞 常用反转录病毒，体外基因转移，弥散的组织多，分散广。对转入外源基因的细胞可检验，考虑安全性及有效性。 2、肌肉细胞 常用。肌肉细胞分布广，含量丰富，为“永久性”细胞，基因不会因分裂而丢失；细胞长而大，且为多核细胞，基因易转移和表达。为“非生命”器官，安全；溶酶体少，外源DNA不易被降解，基因存活时间长；血流丰富，产物可释放入血 3、皮肤 表皮涂抹或肤内注射裸露DNA活脂质体包裹DNA。安全、简便，易行，但皮肤不断更替。 4、其他 如肝细胞、静脉注射等。 五、转移方法 1、化学法 DNA介导：用磷酸钙微量沉淀外源DNA，然后与靶细胞混合。 染色体介导：用秋水仙素处理使染色体固缩，破碎，差速离心，分离出染色体，与受体细胞混合。 脂质体介导：临床已用 受体介导：外源DNA与某些细胞特异性受体的多肽配基形成复合物，与受体结合进入细胞 2、物理法 直接注射法，显微注射法，电穿透法等 3、病毒介导 目前最常用和最成熟的方法 六、基因治疗的临床试验 当前基因治疗试验： 治疗性试验 基因标记 非治疗性试验 治疗性试验 1、遗传性疾病 2、恶性肿瘤 （1）抑癌基因或细胞因子基因治疗 （2）自杀基因系统 （3）抑制血管生成 （4）反义药物 （5）导入MHCI类抗原基因 （6）导入MDR1(Multidrug Resistance)基因 3、病毒性感染 4、其他 遗传疾病 缺失的基因产物 细胞类型 严重联合免疫缺陷 腺苷酸脱氢酶 T/B淋巴细胞 慢性肉牙肿瘤 细胞色素b 中性粒细胞 戈谢病 糖脑苷酶 巨噬细胞 镰刀状细胞贫血 β珠蛋白 红细胞 α和β地中海贫血 α和β珠蛋白 红细胞 Lesch-Nyhan症群 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶 基底神经节 Ducheme肌委缩 萎缩素 肌肉细胞 帕金森病 多巴胺 脑黑质 肺气肿 α1抗胰蛋白酶 肺上皮细胞 囊性纤维化 CF跨膜传导调控剂 肺/胰上皮细胞 苯丙酮尿症 苯丙氨酸羟化酶 肝细胞 家族性高胆固醇血症 低密度脂蛋白受体 肝细胞 血友病A和B 凝血因子Ⅷ和Ⅸ 血小板、肝细胞 遗传性单基因疾病 腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID) 腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID) 第一个基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH) 病因: 淋巴细胞缺乏ADA酶 腺苷、dATP堆积 破坏免疫功能 患儿很少活到成年 治疗策略： 淋巴细胞ADA酶 恢复至正常水平的 5%-10% 维持免疫系统功能 改善病人症状 治疗基本步骤: