第三讲核酸技术.ppt

* * 第三章 核 酸 技 术 核酸的分离和纯化 核酸电泳 染色体DNA电泳 DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制 DNA的连接 PCR技术 分子杂交技术 核酸序列的测定 第一节 核酸的分离和纯化 一、一般程序 1、供体的核酸分离 供体细胞培养 收集(菌体)细胞 细胞破碎 分离总DNA 分离细胞器 分离总RNA 分离细胞器DNA RNA poly(A)RNA 特异性RNA 染色体DNA(组建基因组文库) 2、载体DNA分离 载体DNA 感染或转染细胞（病毒型） 转化细菌细胞（质粒型） 分离病毒颗粒 培养转化细胞、收集菌体 病毒载体DNA分离与纯化 破碎细胞 质粒DNA分离与纯化 3、DNA片段的分离 DNA 限制酶切 凝胶电泳分离 特定DNA片段的回收 4、质量评估 1）?凝胶电泳 2）光密度值测定 3）限制酶切分析 二、细胞裂解 1.?酶法： 利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体，然后加去垢剂使原生质体裂解。 1) 细菌：溶菌酶 2) 酵母：蜗牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase 等 3)?丝状真菌：Novozyme234、溶壁酶、纤维素酶 4)?植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间，反应时尽可能满足酶的最佳反应条件。 2.?机械法 1)?压力剪切法：French压力机，酵母细胞，细菌（芽孢和G+球菌除外） 2)射击破碎法：Braun破碎机，搅切器（blender），混合器（mixer），0.1-0.45mm玻璃球 3)固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球（0.1~0.45mm）同时致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末 4)反复冻融法 三、DNA的分离与纯化 1、供体DNA的分离与纯化 要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物。 1)??? 基因组大小： 染色体 细菌 3300~4200kb 酵母 15,000 kb 果蝇 1.28x105 kb 人 3x106 kb 植物 2x105~1x108 kb 天花病毒 288 kb 痘病毒 196 kb 质体 几~100以上kb 线粒体 藻类 线状 15kb 酵母 环状 19~78 kb 植物 环状 100~150 kb 动物(扁虫到人)环状 15~18 kb 锥虫 网状 6000 kb(幼体) 短膜虫 网状 30,000 kb(幼体) (Kinetoplast） 叶绿体 双子叶植物 121（菠菜）~154kb（豌豆） 单子叶植物 151（玉米）~182kb（浮萍）