环孢素A对咖啡因间歇刺激下的L6细胞肌原纤维降解信号通路的影响.pdfVIP

摘要 目的：本研究通过使用环孢素A 抑制对大鼠L6 肌管细胞钙调神经磷酸 酶的活性，同时使用咖啡因模拟运动时骨骼肌细胞内的环境，观察环孢素A 对泛素-蛋白酶体系统信号的影响，探讨钙调神经磷酸酶是否影响正常状况 以及运动时骨骼肌萎缩信号转导通路。 研究方法：L6 细胞分化 8 天后形成肌管细胞，然后随机分为四组：对 照组，咖啡因组，环孢素A 组，咖啡因+环孢素A 组。每天药物刺激5 小时， 连续刺激 5 天。分别提取蛋白质和核酸，并将全部蛋白和mRNA 样品分别 调为同一浓度。然后荧光实时定量 PCR 检测 FoxO1 、MAFbx 以及MuRF1 的基因表达；Western blotting 检测FoxO1 、MAFbx、MuRF1 、20S 蛋白含量； 荧光定量法检测20S 蛋白酶和钙蛋白酶的活性。 研究结果：1.形态学改变：未分化前，L6 细胞成单核梭形。分化后变 成多核线性的肌管细胞。经过5 天的实验干预，加环孢素A 的两组细胞大小 明显小于另外两组，且咖啡因间歇刺激可以抵抗CsA 诱导的肌管细胞萎缩。 2.荧光实时定量 PCR 结果：慢性间歇刺激下，加咖啡因的两组 FoxO1mRNA 表达下调；MuRF1 和MAFbx 两个基因的表达在各组之间无差 异。环孢素A 并不影响它们的表达。 3. Western blotting 结果 :慢性 间歇咖啡因/ 环孢素 A 刺激 下,FoxO1/MuRF1/MAFbx 和20S 蛋白酶蛋白含量各组之间均无显著性差异。 4.荧光定量酶活性检测结果：环孢素组、环孢素 A+咖啡因组胞浆钙蛋 白酶活性均明显低于其余两组；与环孢素组相比，环孢素 A+咖啡因组钙蛋 白酶活性则明显上调；胞浆20S 蛋白酶的活性各组之间均无显著性差异。 结论：1.间歇咖啡因刺激明显抑制L6 细胞FoxO1 基因表达，但不影响 MuRF1 和MAFbx 的表达。 2.环孢素A 对L6 细胞泛素-蛋白酶体系统的相关信号分子无影响，即钙调 神经磷酸酶不影响泛素-蛋白酶体系统。 3.环孢素A 抑制L6 细胞钙蛋白酶活性，间歇咖啡因刺激减轻其抑制。 关键词：L6 细胞；泛素-蛋白酶体；咖啡因；环孢素A ；钙蛋白酶 I ABSTRACT Objective: This study is based on the L6 myotubes which were treated with cyclosporine A to inhibit calcineurin activity, at the same time, the caffeine was used to keep a similar cellular environment during exercise. Thus, the effect of cyclosporin A on the Ubiquitin-Proteasome system signals was observed to determine whether calcineurin involved in skeletal muscle atrophy signaling pathways during normal and exercise conditions. Methods: After L6 cells turned to myotubes through a process of 8-day differentiation, they were divided into four groups: control group, caffeine group, cyclosporine A group and caffeine+cyclosporine A group. Groups with caffeine were treated to intermitently stimulate for 5 h/d