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济宁青山羊微卫星标记多态性探析 　　摘要：选择位于不同染色体上、具有较高多态性的12个微卫星标记，对济宁青山羊群体的遗传多样性进行研究。结果表明，CSRD247等12个微卫星标记共检测到97个等位基因，每个标记都检测到5个以上的等位基因，平均为8.08个，有效等位基因数为3.1957～6.2113个，基因频率最高的是CSRD247 标记的235 bp 片段（0.4583）；12个微卫星标记多态信息含量（PIC）都在 0.630以上，均为高度多态标记，遗传多样性丰富，其中 SRCRSP5 标记的多态信息含量（PIC）最高，为 0.828，各标记的观测杂合度在0.4286～0.9048之间，期望杂合度在0.5981～0.8397之间，平均期望杂合度为0.7574，属于高度杂合标记和高度杂合品种，遗传变异大。本研究可为济宁青山羊品种的选种、选育及保种工作奠定基础 关键词：济宁青山羊；微卫星标记；多态性；遗传多样性 中图分类号：S827.2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）02-0142-05 济宁青山羊（Jining grey goat）是我国著名的地方山羊品种，2006年被列为国家级畜禽遗传资源保护品种[1]，主要分布在山东省西南地区的济宁、菏泽等地，具有高繁多胎、肉质鲜美、青猾皮轻柔薄暖等优良的种质特性[2]。近年来，济宁青山羊由于受体型瘦小、生长速度缓慢等缺点的限制，与其他品种广泛杂交，纯种处于濒危状态[3] 微卫星DNA又称简单序列重复，广泛存在于原核和真核生物的基因组中。微卫星DNA 两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，尤其在亲缘关系相近的物种间是保守的，在一些紧密相关的物种中，微卫星DNA的重复单位和重复次数具有一定的相似性[4]，因此，可以利用微卫星DNA作为PCR扩增的靶基因，来鉴定物种之间亲缘关系的远近。同时，在同一物种的不同基因型个体间，微卫星DNA的重复单位数目变异大，因而其长度具有高度的多态性，包含大量丰富的信息，可以作为遗传多样性分析的有效手段。微卫星DNA 标记呈共显性孟德尔式遗传，能够鉴别杂合体，对隐性性状的选择十分有利，不受环境条件和其它因素的影响，表现为中性标记。与其它分子标记（如等位酶、RFLP、RAPD 等）相比，微卫星DNA 标记可检测出更多的等位基因，能够提供更细致的基因变化分析范围，具有极显著的优越性[5]。近年来，微卫星DNA在山羊群体多样性分析、群体遗传结构分析、保种效果评价等方面得到了广泛应用[6-9]，为山羊遗传育种提供了重要依据。为了解济宁青山羊群体的遗传多样性，本研究选择12个微卫星标记对济宁青山羊群体进行检测，统计分析标记的多态性、基因杂合度等，以期了解济宁青山羊群体的杂合程度，为品种提纯复壮、繁殖更新、扩大群体规模奠定基础 1材料与方法 1.1 材料与试剂 试验样本采自黄河青山羊保种场（山东省梁山县），随机取12月龄左右济宁青山羊耳组织，每只取5 g，置于装有70%乙醇的灭菌离心管中，-20℃保存备用。共64个样本，试验羊个体间无血缘关系 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、DNA Marker、PCR Mix等均购自天根生化科技（北京）有限公司 ?x器有Eppendorf PCR扩增仪、BIO-RAD凝胶成像仪及电泳系统、ABI 3100-Avant全自动基因序列分析仪、Eppendorf高速台式离心机、NanoDrop 2000分光光度计、电热恒温水槽 1.2基因组DNA提取 采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取羊基因组DNA，-20℃保存备用 1.3引物合成与PCR反应体系 参照联合国粮农组织（FAO）及国际遗传学会（ISAG）的推荐，共筛选出12对荧光标记微卫星引物（表1），由鲁生生物技术有限公司合成。5′FAM为蓝色荧光标记，5′HEX为绿色荧光标记，5′TAMRA为红色荧光标记。以羊样本基因组DNA为模板，利用各种微卫星引物进行PCR反应。PCR反应体系为：PCR Mix 6.25 μL，10 mmol/L上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，补水至12.5 μL。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，相应温度退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；最后72℃延伸5 min。反应结束后，取PCR扩增产物5 μL于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，使用凝胶成像系统进行检测并拍照 1.4微卫星DNA多态性分析 本研究的微卫星多态性分析采用ABI3100-Avant全自动基因序列分析仪进行 具体操作步骤：（1）分别取PCR产物、去离子甲酰胺、内标0.5、10、0.5 μL混合，95℃变性5 min，之后用ABI 3100进行分析