PCR检测技术在奶牛结核病鲜乳样本监测中的应用.pdfVIP

Chinese Joumal of Veterinary Medicine 中国兽医杂志 2016 年(第 52 卷)第 10 JPI 77 PCR 检测技术在奶牛结核病 鲜乳样本监测中的应用 岳 3有 1 ，程振涛2 ，欧德渊2 ，徐春志3 ，袁翠霞3 ，张华l ( 1. 货州省动物疫病预防控制中心，贵州贵阳 55仪泊8 ; 2. 贵州大学动物科学学院， 贵州贵阳 55∞25 ; 3. 贵阳市动物疫病预防控制中心，贵州贵阳 55∞81 ) 摘要:奶牛结核病是一种严茧的人冉，共忠传染病，为lJ!立可快速评估鲜乳污染状况、追溯传播途径的试验方法. 本试验 根据牛分校杆酶基因组合成特异性引物.建立普通 PCR 方法和实时荧光定址 PCR 方法，并评价该方法的性能。 结果可见， 本试验所建立的普通 PCR 方法和实时荧光定量 PCR 方法能有效检测牛分校杆菌目的基因，且均具有饺好的敏感性、特异 性， 可对鲜乳样本进行检测，旦实时荧光定量 PCR 方法比普通 PCR 方法更敏感。 试验结果表明，所.i! PCR 方法可用于鲜乳 样本牛分枝杆菌的定性和l定茧检测.这为鲜乳牛分校杆菌污染状况和食品安全评估提供重要技术。 关键词:鲜乳;牛分校杆部; PCR ;建立 ; 应用 中阁分类号:5852.61 文献标志码:8 文章编号:0529-6005 (2016 ) 10-∞177-03 奶牛结核病( Bovine tuberculosis) 是由牛分枝杆 1 材料与方法 菌(Mycobaclerium bovis) 引起的人兽共患慢性传染 病，严重威胁人类身体健康及公共卫生安全。 研究 1. 1 参考菌株 牛分枝杆菌参考菌株(GIMI- 资料显示，患病奶牛是结核病的重要传染源，可随 267) ，购自上海研生生化有限公司。 大肠杆菌、 葡 鼻汁、粪便和乳汁污染饲料、饮水、鲜乳等，使其呈 萄球菌、链球菌、枯草杆菌等菌株均为贵州大学预 现畜群间和人畜间传播。一些研究认为肺结核病 防兽医学实验室提供; 副结核分枝杆菌、 禽结核杆 人中约 1 5% 的结核病人是饮用了结核病牛的奶而 菌由贵州大学动物疫病研究所提供。 发病[ 1 ] 。 奶牛结核病传统检测方法有细菌分离鉴 1. 2 主要试剂 改良罗氏培养基，购自上海研生生 化有限公司;细菌基因组 DNA 提取试剂盒、SYBR⑧ 定、免疫学检验等方法，随着分子生物学技术发展， PCR 技术被广泛应用于疫病诊断、动物性食品卫生 Premix Ex Ta~t 1( Perfect Real Time) 试剂盒，购自宝 安全等领域[ 叫，其可用于鼻液、乳样、血液等样本 生物工程(大连)有限公司。其他试剂为国产分析纯。 1. 3 引物合成参考GenBank 数据库牛分校杆菌 的检测。 我国《动物结核病诊断技术》国家标准 (GB/T 18645-2∞2) 规定，乳液可以作为检测样本 基因序列(CP009449 . 1) ，基于插人序列 IS6110 基 因合成 l 对牛分枝杆菌特异性引物( TB-P-F: 5- 用于牛结核病诊断，与其他诊断检测样本比较，鲜 乳样品具有易采集、对动物无伤害等优点，提高了 GGATCCTGCGAGCGTAGGCG-3 , TB -P-R : 5-CAT- 监测样本采集效率。为贵州省奶牛结核病流行状 CAGCCGCGTCCA