免疫层析胶体金试纸条检测EDS76病毒抗原的研究.pdfVIP

免疫层析胶体金试纸条检测EDS-76病毒抗原的研究 王爱华‘2王玉珠1孙继国“+陈龙宾‘ (1．河北农业大学动物科技学院i河北保定071001；2．河北北方学院动物医学系河北宣化075131) 摘要采用柠檬酸三钠还原氯金酸，制各胶体金颗粒。根据不同粒径的胶体金颗粒在检测时所呈现的颜色鲜艳 Ilg／mL。用试纸条能检出浓度约为 程度，选择15pm的胶体金颗粒作为标记物，试验测得待标记抗体最低稳定量为40 1．35u 结果表明，该试纸条用于检测EDS-76病毒快速、操作简便、特异性强，可用于大批量抗原样本的检测。 关键词胶体金检测鸡减蛋综合征病毒试纸条 EDS．76)是由腺病毒引起，使产蛋鸡产蛋率下降的传染性 鸡减蛋综合征(Eggdropsyndrome．76 疾病【l,21。1976年VanEck首次报道予荷兰，1991年我国分离到病毒【孔。在我国流行范围较厂“，对养 鸡业造成了巨大的损失。与其他疾病不同，减蛋综合征不直接引起鸡的死亡，而是通过产蛋量突然 急骤下降、蛋质低劣危害养鸡业H1。虽然近年来随着疫苗的广泛应用，减蛋综合征的大规模爆发流 行己得到明显控制，但该病依然存在，近年来，在荷兰‘卯、日本‘们、印度‘7矧和我国‘91都有该病 发生的报道。目前，检测EDS-76病毒的方法很多，这些方法都具有其不可替代的优点，但也有其自身 的不足。本研究的胶体金试纸条为EDS一76病毒感染的临床诊断提供一种特异、简便、实用性强的抗 原检测方法，报道如下。 1材料 (IBDV)、肾型传染性支气管炎病毒(IBV)尿囊液均为本实验室保存。 1．2抗体：羊抗兔血清，兔抗EDS-76血清，鸡抗EDS一76血清自制。 1．3硝酸纤维素膜、吸水垫、玻璃纤维：美国Millipore公司生产。 1．4氯金酸：北京化工厂。 2．方法 解，4C条件沉淀4h，4C HA滴度，紫外分光光度计测定其病毒蛋白含量，电镜观察。 羊抗兔抗体，HI法测定抗EDS-76病毒抗体的效价；紫外分光光度计测定其血清IgG含量。 2．3胶体金颗粒的制备及质量鉴定所用玻璃器皿洗净、硅化。取O．01％氯金酸水溶液lOOmL加热 至沸，迅速加入适量的1％柠檬酸三钠水溶液，以制备不同径粒的胶体金，混匀继续加热，金黄色 的氯金酸水溶液很快变色，继续煮沸数分钟，冷却后以蒸馏水恢复到原体积。取少量胶体金溶液滴 在覆有Formvar膜的铜网上，空气中干燥。在透射电镜下观察胶体金颗粒的大小是否均匀一致，有 无椭圆形、三角形和多角形，并且使用电镜的统计功能取多个胶体金颗粒，计算其平均直径。 2．4免疫胶体金制各抗体经透析、离心处理，测定标记的最低稳定量。按照标记物的总量，决定 所需胶体金和抗体的量。在磁力搅拌器上快速旋转，缓慢加抗体溶液，然后加过滤的10％BSA保 存液至终浓度1％。用TBS缓冲液洗涤2次标记物，然后4C保存。 2．5胶体金免疫电镜 ’作者简介：王爱华(1966--)，女，河北省东光县人，副教授j硕士． cn． 幸通讯作者：孙继国，教授，E-mail：Sunjigu020000yahoo．COffL 148 滴1滴EDS一76病毒于干净的腊盘上，轻轻地将覆盖有Forvwar膜的铜网悬浮其上，室温吸附 用20min，PBS洗5次，吸去余液；然后用磷钨酸负染3min，干燥后电镜观察。 2．6胶体金试纸条组装 胶体金试纸条由支持板、硝酸纤维素膜、吸水垫、玻璃纤维组成。组装方式见下图： j } + } | ；p j } 上 瞿瞿 2．7特异性试验 液进行检测试验，根据其显色情况判定结果。 性血清和阴性血清IgG混匀，4C过夜，用试纸条检测，同时设阳性对照，观察其显色情况。 2．8稳定性试验 测灵敏度；置于37C者每天取出3