重组内皮抑素的性质表征与生物活性分析.pdfVIP

第33 卷 分析化学 （FENXI HUAXUE ） 研究报告 第4 期 2005 年4 月 Chinese JournaI of AnaIyticaI Chemistry 459 ~ 462 重组内皮抑素的性质表征与生物活性分析 1 2 2 ＊ 王 群 季怡萍 倪嘉缵 1 （上海交通大学药学院，上海200030 ） 2 （中国科学院长春应用化学研究所稀土化学与物理开放实验室，长春 130022 ） 摘 要 通过SDS电泳、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、高效液相色谱、地高辛方法、蛋白印迹方 法、鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和透射电子显微镜法对重组内皮抑素进行纯度分析、鉴定和生物活性研究。 重组内皮抑素纯度达到99% ，能够抑制鸡胚尿囊膜新血管生成和人脐静脉内皮细胞ECV304 增殖，引发内皮细 胞的凋亡。 关键词 重组内皮抑素，质谱，电镜，细胞凋亡 1 引 言 肿瘤的生长依赖于血管生成，新生血管不仅为肿瘤生长运送必需的营养物质，而且为肿瘤细胞扩散提 ［1］ 供了重要的途径 。内皮抑素（endostatin ）是胶原 的C 末端片段，作为一种内源性血管生成抑制因子， ! 显示出特异抑制激活的血管内皮细胞增殖和肿瘤新血管生成的活性，其抗肿瘤作用具有高效、低毒、无耐 ［2 ］ 药性的优点 。目前，内皮抑素的研究引起了国内外广泛的兴趣，在美国已进入以安全性为目的的期临 # ［3 ］ ［4 ］ 床验证阶段 ，国内也有多家公司已开展抗肿瘤研究并申报一类新药 。内皮抑素具有重要的应用前景， 但能否作为药物应用于临床，尚需对其结构特点及抑制内皮细胞的作用机制等进行深入地研究。 本工作从人胚肝组织中提取内皮抑素基因，运用基因工程技术，从大肠杆菌中制备了N 末端带有 6 X His Tag 的重组内皮抑素蛋白，分别用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）、高效液相色 谱（HPLC ）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS ）法测定了其纯度和分子量，地高辛 （DIG ）方法检测了残余DNA 的含量，蛋白印迹（western-DIot ）方法对蛋白进行鉴定，鸡胚尿囊膜（CAM ）实 验和透射电镜（TEM ）法研究了重组内皮抑素对鸡胚尿囊膜新生血管和内皮细胞ECV304 的抑制活性。本 实验采用多种技术方法对重组内皮抑素进行全面分析、表征和鉴定，为进一步进行肿瘤治疗药物研究并成 为临床用药奠定了基础。 2 实验部分 2. 1 仪器与试剂 LDI-1700 型基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（美国Linear Scientific 公司）；Phast System 多功能 快速水平电泳仪和Phast Transfer Semi-dry Transfer Kit（瑞典Phamacia Biotech 公司）；SHIMADZU HPLC 系 统（日本岛津公司）；H600-A 透射电子显微镜（日本日立公司）。低分子量标准蛋白（美国MBI 公司）；芥子 酸（美国Linear Scientific 公司）；小鼠抗内皮抑素单克隆抗体（McAD ）和羊抗小鼠IgG 抗体（美国Sigma 公 司）；地高辛DNA 检测试剂盒（德国Roch 公司）；人脐静脉内皮细胞ECV304 （中国科学院上海细胞库）； AFM 鸡胚