第二章菌种分离和纯化2-2.pptVIP

(一)样品采集 原则： 一、样品来源广泛 二、了解目标产物的性质和可能产目标产物的微生物种类极其生物特征 土壤中样品采集注意： 1、土壤微生物的分布2、采土深度3、土壤植被情况4、采样季节 5、土壤的酸碱度 从自然界筛选 (二)样品预处理 目的：提高分离效率 热处理 物理方法 膜过滤法 方法 离心法 化学方法（例添加几丁质分离放线菌） 诱饵法（用固体诱饵富集某些特殊微生物） 毛细管分离和小滴分离法 从菌体悬浮液中寻找单细胞或单孢子，用毛细管或滴管前段拉成毛细管，吸取后转入斜面培养。 菌种的初筛和复筛 初筛：从分离到的大量微生物中筛选有目的产物合成能力的微生物 方法：平板筛选 、 摇瓶发酵筛选 菌种的初筛和复筛 复筛：初筛基础上进一步鉴定菌株生产能力的筛选。 结合各种培养条件，如培养基、温度、pH、供氧量等进行筛选 菌种认证的权威机构 中国微生物菌种保藏管理委员会CCCCM 中国科学院典型培养物保藏委员会 CTCCCAS 中国典型培养物保藏中心 CCTCC 中国工业微生物菌种保藏管理中心 CICC 美国典型培养物保藏中心 ATCC 英国国家典型培养物保藏中心UKNCC 法国巴斯德研究所菌种保藏中心CIP 德国科赫研究所菌种保藏中心 RKI 三、基因的直接进化(directed evolution) 突变 基因突变库的建立 筛选 基因突变库的筛选 基因复制与遗传 步骤： 在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。 主要应用： 酶学性能的提高: pH 温度 有机溶剂 生理环境→工业催化环境 底物专一性 脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯 例： PLA PLA光学拆分选择性(%) 2 31 57 75 81 90 5次错位PCR 2次定点突变 Reetz (1997) Liebeton(2000) 定点突变 错位PCR DNA Shuffling:指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(Sexual Recombination)。 X XXX X XX X XX X XXX X XX X X XXX XX X X XX X XXX X X XXX XX X X XX X XXX X XX X XX X XX XXX X X X X X XX X Fragment Reassemble Select best with DNAseI fragments recombinants Repeat for multiple cycles DNA shuffling 高 部分基因组 几天 特定基因/ 操纵子/病毒 快速进化 DNA Shuffling 低 完整基因组 多年 整个基因组 缓慢进化 常规定向进化 突变效率 影响对象 进化 周期 进化对象 进化速度 项目 DNA Shuffling与常规定向进化的比较 生物制药 12 汞解毒 汞代谢途径 基因治疗 12 37℃半衰期 肿瘤抑制因子P53 生物制药 40 砷酸盐解毒 砷酸盐代谢途径 代谢途径 基因治疗 285，000 抗病毒 人类干扰素 细胞因子 工业酶 17 200 耐热性 65℃耐热时间 枯草杆菌蛋白酶E 抗生素 32，000 抗生素抗性 β -内酰胺酶 生物制药 10，