蛋白酶抑制剂的明胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt

实验二  蛋白酶抑制剂的明胶-聚丙烯酰胺凝胶电泳 一. 目的： 1.学习和掌握蛋白酶抑制剂电泳基本原理及电泳技术。 2.熟练掌握蛋白酶抑制剂电泳有关试剂配制的技术和制胶技术。 二、原理： (一).聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis）: 是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。 单体的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide，简称Acr） 甲叉双丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N’-methylenebisacrylamide,简称Bis） 聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。 常用的催化聚合方法有两种： 化学聚合和光聚合。 化学聚合:加入催化剂过硫酸铵［（NH4 ）2S2O3]（即AP）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基，这样由于乙烯基“CH2=CH－”一个接一个的聚合作用就形成丙烯酰胺长链，同时甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键交联，从而形成交联的三维网状结构。 氧气对自由基有清除作用，所以通常凝胶溶液聚合前要进行抽气。 光聚合:催化剂是核黄素，核黄素在光照下能够产生自由基，催化聚合反应。一般光照2－3小时即可完成聚合反应。 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起。 链间纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性能。 网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。 长链上富含酰胺基团，使聚丙烯酰胺成为稳定的亲水凝胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。 这些特点使得聚丙烯酰胺特别适于作区带电泳的支持介质。 改变凝胶浓度（T％）和交联度（C％），可获 得不同密度、粘度、弹性、机械强度和孔径大小的 凝胶，以适应各种样品的分离。 一般常用7.5%浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质， 用2.4%的分离核酸。但根据蛋白质与核酸相对分子质量的不同，适 用的浓度也不同。 富有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30 左右。选择T和C的经验公式是： C = 6.5－0.3T 此式可用于计算T为5％～20％时的凝胶组成。C值并 不很严格，在大多数情况下，可变化的范围约为 ?1％， 当C保持恒定时，凝胶的有效孔径随着T的增加而减小，当 T保持恒定，C为4％时，有效孔径最小，C大于或小于4％ 时，有效孔径均变大，C大于5％时凝胶变脆，不宜使用， 实验中最常用的C是2.6％和3％。 聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉 双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3％～ 30％之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3％的聚丙 烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于平板等 电聚焦或SDS－PAGE电泳的浓缩胶，也可以用于分离DNA； 高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用， 可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如10 ％～20％的凝胶常用于SDS－PAGE电泳的分离胶。 由于聚丙烯酰胺凝胶有突出的优点，因而四十年来得 到广泛的应用，目前尚无更好的支持介质能够取代它。其 主要的优点有：①可以随意控制胶浓度“T”和交联度“C”， 从而得到不同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大 分子。②能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中， 达到更高的灵敏度：10－9 ～10－12 mol/L。③由于聚丙 烯酰胺凝胶是由－C－C－键结合的酰胺多聚物，侧链只有 不活泼的酰胺基－CO－NH2 ，没有带电的其他离子基团， 化学惰性好，电泳时不会产生“电渗”。④由于可以制得高 纯度的单体原料，因而电泳分离的重复性好。⑤透明度 好，便于照相和复印。机械强度好，有弹性，不易碎，便 于操作和保存。⑥无紫外吸收，不染色就可以用于紫外波 长的凝胶扫描作定量分析。⑦还可以用作固定化酶的惰性 载体。 (二).影响电泳迁移率的因素 ⒈电场强度 电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势 梯度。如以滤纸作支持物，其两端浸入到电极液中，电极 液与滤纸交界面的纸长为20cm，测得的电位降为200V，那 么电场强度为200V/20cm＝10V/cm。当电压在500V以下， 电场强度在2-10v/cm时为常压电泳。电压在500V以上，电 场强度在20-200V/cm时为高压电泳。电场强度大，带电质 点的迁移率加速，因此省时，但因产生大量热量，应配备 冷却装置以维持恒温。 ⒉溶液的pH值 溶液的pH决定被分离物质的解离程度和质点的带电性 质及所带净电荷量。例如蛋白质分子，它是既有酸性基团 （-COOH），又有碱性基团（-NH2）的两性电解质