3种结肠癌细胞株中DLC1基因的表达及其启动子区的甲基化状态研究论文.docVIP

　　3种结肠癌细胞株中DLC1基因的表达及其启动子区的甲基化状态研究论文 【摘要】 目的:研究候选抑癌基因DLC1在结肠癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态，初步探讨结肠癌细胞株DLC1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性。方法：采用RTPCR技术分别检测DLC1基因在人结肠癌细胞株CaCo2、HT29和LoVo中的表达水平；应用甲基化特异性PCR(MSP)方法和亚硫酸氢盐修饰DNA测序检测启动子区域甲基化状态；分别用0、5、10 μmol·L-1浓度的去甲基化药物5氮杂胞苷处理DLC1基因启动子区域高甲基化状态细胞后，再检测DLC1基因mRNA表达水平。结果：人结肠癌细胞株CaCo2和LoVo中DLC1 mRNA呈阳性表达，HT29中的表达呈阴性表达；CaCo2和LoVo细胞DLC1基因启动子区域未发生甲基化，而HT29出现启动子区高甲基化状态；经5氮杂胞苷药物干预后，HT29结肠癌细胞的DLC1基因表达明显增强。结论：结肠癌细胞株HT29中DLC1基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关。 【关键词】 DLC1基因 甲基化 结肠癌细胞株 甲基化特异性PCR DLC1（frequently deleted in liver，DLC1）基因，位于人类染色体8p2122.freelin；94℃变性30 s，按表1温度退火30 s，72℃延伸40 s，共4２个循环；最后72℃延伸7 min。PCR产物于1.7％的琼脂糖凝胶电泳观察。 1.3基因组DNA的制备及亚硫酸氢盐修饰 用饱和酚、氯仿抽提DNA，乙醇沉淀。沉淀用70％乙醇洗涤，干燥后溶于TE缓冲液中，用紫外分光光度计定量。取1～3 μg基因组DNA，3 mol·L-1 NaOH使DNA充分变性。向已变性的DNA中加入新配制的3 mol·L-1亚硫酸氢钠(pH 5.0)和对苯二酚，充分混合，离心后加上200 μl石蜡油封层，50℃保温10～16 h。用SP）检测 亚硫酸氢盐修饰DNA经两对引物扩增，分别为甲基化与非甲基化引物扩增（引物序列见表１），扩增片段为DLC1基因启动子区且包含6个CpG位点6。反应条件均为94℃预变性3 min；94℃变性30 s，按表1温度退火30 s，72℃延伸40 s，共45个循环；最后72℃延伸7 min。PCR产物于1.7％的琼脂糖凝胶电泳观察。 1.5 亚硫酸氢盐基因测序（sodium bisulfite genomic sequencing） 亚硫酸氢盐修饰 CaCo2、LoVo和HT29细胞株DNA经PCR扩增DLC1基因启动子区CpG位点（引物序列见表１）。PCR反应条件与MSP相似，退火温度按表1，对扩增产物进行测序。 1.6去甲基化药物5氮杂胞苷处理HT29细胞 分别用0、5、10 μmol·L-1不同浓度5氮杂胞苷（5AzaCdR，Sigma公司）处理HT29细胞，每24 h更换新的含相同药物浓度的培养液，作用3 d，处理结束后再用常规培养液培养1 d后提取RNA，检测DLC1基因mRNA的表达水平，以βactin为内参照（引物序列及反应条件同方法2）。表１ 各种引物序列及反应条件 2 结 果 2.1 CaCo2、LoVo和HT29细胞DLC1基因mRNA的表达 RTPCR检测结果显示，结肠癌细胞株CaCo2和LoVo出现262 bp大小的目的条带，而HT29结肠癌细胞株未检测到DLC1基因mRNA的表达（图1）。 2.2 DLC1基因启动子区甲基化检测结果 MSP检测结果显示，CaCo2和LoVo细胞株DLC1基因非甲基化引物扩增出172 bp大小的目的片段，HT29细胞株甲基化引物扩增出178 bp目的条带（图2）。DLC1基因启动子区扩增产物291 bp（图3）,其测序结果与GenBank AF035119第168位至220位核苷酸序列比对，其中LoVo细胞株6个CpG位点未发生甲基化（图4）,而HT29细胞株发生甲基化（图5）。 2.3 5氮杂胞苷处理HT29细胞后DLC1基因mRNA的表达结果 HT29细胞DLC1基因的mRNA表达，在给予10 μmol·L-1 5氮杂胞苷药物后比未处理组明显增强（图6）。 3 讨 论 目前认为DLC1基因可能是一个新的肿瘤抑制基因，其cDNA序列与鼠 p122 RhoGAP(Rho GTPase activating protein,RhoGAP)基因有着82%的同源性。DLC1和p122序列都有一个RhoGAP结构域，该结构域与细胞骨架形成、细胞黏附性、细胞增殖等有密切关系78。DLC1基因失活将使Rho蛋白过度表达，从而向细胞内持续传递