CD59基因突变在肿瘤逃逸中的作用论文.docVIP

　　CD59基因突变在肿瘤逃逸中的作用论文 【摘要】 目的 构建CD59突变的重组体，研究Hela细胞中CD59基因突变引起肿瘤凋亡相关分子caspase3表达的变化。方法 采用重组聚合酶链反应定点诱变技术，将CD59的第39～41位氨基酸突变为色氨酸，克隆入pALTERMAX质粒，采用阳离子脂质体法将重组质粒转染Hela细胞。G418筛选稳定表达细胞克隆，用免疫荧光、ELISA、流式细胞术筛选出高表达突变CD59的细胞株，用免疫组化法检测转染前后Hela细胞内caspase3表达的变化。结果 酶切鉴定和序列测定均证实成功构建了CD59氨基酸突变的重组质粒。转染突变CD59后Hela细胞内caspase3表达明显减少，与转染正常CD59的Hela细胞比较差异有显著意义（t=2.846,P 0.01)。结论caspase3表达变化可能是CD59引起肿瘤逃逸的另一途径。 【关键词】 抗原 CD59 点突变 肿瘤逃逸 基因重组 Hela细胞 Caspase 3 ［ABSTRACT］ Objective To construct mutant CD59 molecular, and study the alleosis in the expression of caspase3 correlative or apoptosis brought about by CD59 mutation in Hela cells. Methods Using polymerase chain reaction sitedirected mutagenesis, the amino acid of the 39th and the 41th mutated to tryptophanes. Mutant CD59 DNA inserted into the vector pALTERMAX and transfected into the Hela cells via lipofectamine method. Stable expression clones utant CD59 munofluorescence method, ELISA and floetry. The expression of caspase3 in Hela cells before and after transfection munohistochemically. Results Rebinant plasmids of pALTERMAXCD59 had been successfully constructed according to sequence of enzyme digestion analysis and fragment investigation. The amount of caspase3 in Hela cells al CD59, and the difference or escaping may be the expression changing of caspase3. ［KEY utagenesis; Hela cells; Caspase3 众所周知.freelerican Biotec公司，RPMI 1640培养基、G418选择抗生素、LipofectamineTM2000均为Invitrogen公司产品，鼠抗人CD59单抗为本实验室制备，羊抗鼠IgG2aFITC、羊抗人CD59单抗和HRP标记兔抗山羊IgG（H+L）均购自北京中山生物技术有限公司，荧光抗体CD59FITC购自COULTER 公司，caspase3免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，Hela细胞由本实验室保存。设计两对寡核苷酸引物，通用引物：pT7，T3；突变引物：M/F，M/R。以上引物均购自上海生物工程有限公司。 1.2 方法 1.2.1 重组真核表达载体的构建 在原构建的重组质粒pALTERCD59的基础上, 设计两对反向互补、含有突变位点的引物及一对通用引物，由生物公司合成。其序列如下。通用引物pT7：5′TAATACGACTCACTATAGGC3′；通用引物T3：5′TATTCAGGCGTAGCAACCAG3′ ；突变引物M/F：5′GTGTATAACAAGTGGTGGTGGTTTGAGCATTGC3′； 突变引物M/R：5′ATGCTCAAACCACCACCACTTGTTATACACTTG3′。 以已构建的CD59 cDNA重组质粒为模板，以常规引物pT7和诱变引物M/R进行PCR1反应，以已构建CD59 cDNA重组质粒为模板，以常规引物T3和诱变