HCV核心蛋白与HCBP1在哺乳双杂交系统中的相互作用论文.docVIP

　　HCV核心蛋白与HCBP1在哺乳双杂交系统中的相互作用论文 陈云茹 刘敏 陈天艳 张树林 陈瑞琳 张曦 石磊 【摘要】 目的：探讨HCVcore与HCBP1的相互作用. 方法：PCR分别扩增含HCV core及HCBP1的cDNA片段，克隆入pGEM T载体，经测序正确后再分别克隆入哺乳双杂交的表达质粒pM 和pVP16中，并转染入COS7细胞，48 h后检测细胞中报告基因CAT的表达水平. 结果：CATELISA检测显示pMcore与pVP16HCBP1实验孔A405 nm值为0.1288，高于其它阴性对照，但低于阳性对照组A值. 结论：哺乳双杂交系统证实HCV核心蛋白与新基因HCBP1有一定的相互作用，可进一步研究HCBP1的细胞功能. 【关键词】 HCV核心蛋白；哺乳双杂交；报告基因 基金项目：国家自然科学基金；陕西省科学技术研究发展计划项目（2004K15G1） 【Abstract】 AIM: To analyze the interaction betammalian tents encoding HCV core protein and HCBP1 plified by PCR and subsequently cloned into pGEM T vector, respectively. After verified by sequencing, they ids, pM and pVP16. Then, pMcore, pVP16HCBP1 and pG5CAT, a reporter vector, all ent group malian ts HCBP1 can bind e extent. Based on this, ammalian tmalian MATCHMAKER Tega公司），DNA重组所用的各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶（大连宝生物公司）；DNA凝胶回收试剂盒Lipofectamine2000（Invitrogen公司），测序由上海生工生物工程有限公司完成. COS7细胞（中国科学院细胞库）; PureYield TMPlasmid Midiprep System（美国Promega公司）. 1.2 方法 1.2.1 PCR扩增 克隆编码核心蛋白基因的上游引物P1：5′GAATTCATGAGCACGAATCCTAAACCTC3′； 下游引物P2：5′GAATTCGGCTGAAGCGGGCACAGTC3′；以质粒pGBKT7HCV core为模板，PCR反应条件为：94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 60 s，共35个循环. 克隆编码HCBP1蛋白基因的上游引物P1：5′GAATTCATGTGCTCACTGCCTGTGCCCCG3′；下游引物P2：5′GGATCCGGAAGCTGGGCTCGGGGCAG3′；以肝cDNA文库为模板，PCR反应条件为：94℃ 60 s，63℃ 60 s，72℃ 60 s，共30个循环. 1.2.2 PCR产物的克隆及鉴定 回收的PCR产物与pGEM T 载体相连，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白筛选. 用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定及PCR鉴定后将含插入片段的阳性克隆分别命名为pGEM Tcore及pGEM THCBP1，进行序列分析. 1.2.3 表达载体的构建及鉴定 用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切pGEM Tcore和表达载体pM，pGEM THCBP1和pVP16，回收core protein，pM，HCBP1及pVP16，载体与插入片段连接后转化大肠杆菌DH5α，经限制性内切酶和PCR分析，含正确插入片段的克隆分别命名为pMcore和pVP16HCBP1，并用质粒提取试剂盒进行大规模的质粒提取和纯化. 1.2.4 转染COS7细胞 于转染前1日将细胞用胰酶消化，计数并铺板，使转染当日细胞融合度为90%～95%. 在铺板和转染期间避免使用抗生素. 对每个转染样本进行如下操作：① 在500 μL无血清的培养基中稀释以下三种质粒共8.8 μg，使pMcore质粒∶pVP16HCBP1∶CAT质粒比例为5∶5∶1; ② 在每孔中，用500 μL无血清培养基稀释22 μL阳离子脂质体试剂，室温孵育5～10 min; ③ 将稀释的DNA同稀释的脂质体试剂混合，室温保温20 min; ④ 用1 mL无血清培养基在转染前清洗细胞; ⑤ 将质粒DNA与脂质体试剂的混合物加入细胞，37℃ 50 mL/L CO2保温6 h; ⑥ 6 h后弃去复合物，加入新鲜的完全培养基至正常体积; ⑦ 转染48 h后，弃去细胞培养液，用5 mL冰预冷的PBS洗