HIF1α反义寡核苷酸增强胃癌细胞对顺铂的敏感性论文.docVIP

　　HIF1α反义寡核苷酸增强胃癌细胞对顺铂的敏感性论文 邓守恒 ,孙各琴,周有利,朱名安,邓守明 【摘要】 目的 研究缺氧诱导因子－1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF1α）反义寡核苷酸（antisense oligodexynucleotide,ASODN）对人胃癌细胞凋亡及化疗药物敏感性的影响。方法 人工合成HIF1α ASODN经阳离子脂质体包裹后瞬时转染人胃癌SGC7901细胞系。采用RTPCR和免疫细胞化学检测转染后HIF1α基因表达情况,ＭＴＴ法观察化疗药物敏感性的变化,AO/EB染色及TUNEL检测 SGC7901细胞转染后顺铂诱导的凋亡。结果 经HIF1α ASODN处理的SGC7901细胞HIF1α基因表达明显下调,HIF1α ASODN处理的SGC7901细胞加顺铂作用后与对照组比较,细胞凋亡率明显增加,化疗药物敏感性增强。结论 阳离子脂质体转染HIF1α ASODN具有促进化疗药物诱导胃癌SGC7901细胞凋亡及增强化疗药物敏感性作用。 【关键词】 胃癌;反义寡聚核苷酸；缺氧诱导因子－1α;凋亡;顺铂 HIF1α Gene Antisense Oligodexynucleotide Enhances the Sensitivity of Gastric Carcinoma Cells to Cisplatin Key a;Antisense oligodexynucleotide;HIF1α；Apoptosis；Cisplatin 实体瘤生长迅速造成血供相对减少，局部缺氧极易发生。缺氧导致肿瘤细胞对化疗药物抗拒性增加。HIF1是调节肿瘤细胞对缺氧等微环境发生适应性反应的主要核转录因子，HIF1α是决定HIF1活性的亚单位。HIF1α在胃癌等多种恶性实体瘤中高表达，与肿瘤的血管形成，侵袭转移，放化疗耐受等恶性行为密切相关，HIF1α可能是癌症分子治疗中一个极具潜力的靶点［1］。本实验中我们采用阳离子脂质体介导HIF1α ASODN转染人胃癌细胞系SGC7901.freelega）。 1．2方法 1．2．1HIF1α ODN的合成与修饰 HIF1α ASODN 5‘GCCGGCGCCCTCCAT 3’,并设置了HIF1α SODN作为对照,.freelol/L氯化钴的1640培养液进行化学模拟缺氧实验,置于37℃、5%CO2，饱和湿度的细胞培养箱中继续培养。实验取对数生长期细胞。 1.2．3实验分组与处理 细胞悬液直接种至6孔培养板内培养，转染时取对数生长期细胞，并融合50%～60%，每种处理有3孔。实验分四组：反义寡核苷酸组（终浓度为5.0μmol/L）、空白对照组、脂质体转染对照组和正义寡核苷酸转染对照组（终浓度为5.0μmol/L）。按照Dosper转染试剂盒说明进行细胞转染。24h后各组均加入顺铂（终浓度10μg/ml）再继续培养24h。中止培养，收集细胞爬片固定备用。 1.2.4RTPCR和免疫细胞化学检测HIF1α基因表达变化 按照1.2.3方法分组，转染后培养24h中止培养。以0.25％胰蛋白酶消化收集各组细胞， 用Trizol提取细胞总RNA，用琼脂糖电泳来确定所提取的RNA是否降解，并以分光光度计测OD值。cDNA的合成按逆转录试剂盒说明书进行。PCR反应条件为：95℃预变性5min,接着95℃,30s; 56℃,45 s; 72℃,60s; 35个循环，最后72℃总延伸10min。HIF1α的上游引物为：5‘GACAAGCCACCTGAGGAGAG 3’，下游引物为：5‘GTTCGCATCTTGATAAGGCC 3’,381bp。同时选用β肌动蛋白（βactin）的mRNA扩增为内参照，其上游引物为：5‘GGCATGGGTCAGA AGGATTCC 3’，下游引物为：5‘ATGTCACGCACGATTTCCCGC 3’,500bp。取10μｌ扩增产物2%凝胶电泳,用NIH ImageJ凝胶图象分析仪分析，计算所得产物的积分光密度与各自内参照积分光密度的比值来反映该基因mRNA的水平。另取少量消化后收集的细胞制作细胞涂片，经4％多聚甲醛固定15min按照常规免疫细胞化学染色方法检测HIF1α蛋白表达水平。DAB染色细胞核中出现棕色颗粒者为阳性。采用阳性细胞百分比法，计数不同高倍视野共300个细胞，得出阳性率。 1．2．5MTT法检测胃癌细胞增殖活性 SGC-7901细胞经消化后计数,以1.5×105个/ｍl接种96孔板,每孔加200μl含10%胎牛血清和氯化钴（终浓度为125μmol/L）的1640培养液,在5%CO2、37℃孵箱中培养24ｈ。培养细胞分组及转染处理同前。转染