HIV1 Tat 蛋白结合Tar的抗艾滋病药物筛选模型的建立研究论文.docVIP

　　HIV1 Tat 蛋白结合Tar的抗艾滋病药物筛选模型的建立研究论文 李在留 刘朝奇，邹坤，李凤兰，韩钰，杨凡，王磊黎 【摘要】 目的建立HIV-1 Tat蛋白结合Tar的抗HIV-1药物筛选模型用于抗HIV药物筛选。方法构建表达HIV-1 Tat 蛋白的真核表达质粒（pCDNA3.1(+)-Tat）和HIV-1 LTR-luc荧光素酶报告基因，采用脂质体转染法共转染HeLa细胞，荧光仪检测Tat蛋白促进荧光素酶在HeLa细胞内的表达情况.freelodel. MethodsHIV-1 Tat protein eukaryotic expression plasmid （pCDNA3.1(+)-Tat）and luciferase report gene HIV-1 LTR-luc(LTR-LUC) ine 2000. The expression of HIV-1 Tat protein in HeLa cells inometer. HIV-1 Tat protein binding tar model for screening HIV-1 inhibitors idazole) odel ents indicate that the matching of purpose gene and report gene, the rate of ne in medium during transfection , density of the transfected cells, condition of the untransfected cells and the action time of drugs affect the stability and sensitivity of the model. Key RNA的翻译，导致病毒的复制增加［6］。本研究通过建立HIV-1 Tat 和LTR的结合，导致报告基因荧光素酶在细胞内的高表达，反映Tat 和LTR序列的有效结合，建立Tat的反式激活效应调控病毒基因的复制与表达模型，从而用于天然药物有效成分的筛选，具有简单、快速、微量、费用低廉、安全、不受P3实验室限制，不用同位素等特点，可为实验室建立抗HIV-1药物筛选模型提供借鉴与指导，具有较强的实践意义。 1 材料与方法 1.1 材料 HIV-1 Tat 蛋白的真核表达质粒pCDNA3.1(+)-Tat及报告基因 HIV-1 LTR-luc(LTR-LUC)由三峡大学分子生物学研究所构建保存。 HeLa细胞株由北京协和医科大学惠赠。Lipofectamine 2000、Opti-MEM培养液均为Invitrogen公司试剂，新生牛血清（NCS）为GIBCO公司产品。DMEM培养基、胰蛋白酶、底物Luciferin、阳性对照DRB，细胞裂解液1,2-diaminocylclohexane-N,N,N,N-tetraacetic acid，考马斯亮兰等药品均为Sigma公司产品。 1.2 方法 构建表达HIV-1 Tat 蛋白的真核表达质粒（pCDNA3.1(+)-Tat）、HIV-1 LTR-luc荧光素酶报告基因，采用脂质体转染法共转染HeLa细胞，荧光仪检测Tat蛋白在HeLa细胞内的表达情况，建立HIV-1Tat蛋白结合Tar的抗HIV-1的药物筛选模型。转染后的细胞加入对细胞毒性在20%以下的药物浓度，以DRB为阳性对照（Tat/Tar抑制剂，Mancebo et al., 1997; Nekhai et al，1997），培养一定时间后收集细胞裂解液上清检测相对荧光值（RLU），考马斯亮兰（G-250）测定蛋白含量，在蛋白含量统一的条件下，药物对Tat蛋白表达的抑制作用表现为药物组与空白对照组RLU的差值。 1.2.1 HeLa细胞脂质体转染实验按 Lipo fectamine 2000的说明书进行操作：①转染前1天HeLa细胞以2×105cells/ml 浓度接种到24孔板，0.5 ml/孔，置37℃，5%CO2培养箱中培养过夜。②转染前1h对待转染细胞换等体积、新鲜、不含抗生素的DMEM培养液，置37℃，5%CO2培养箱中孵育1h。③DNA-Lipofectamine共沉淀物的制备：A：pCDNA3.1(+)-Tat与LTR-Luc的稀释与混合：pCDNA3.1(+)-Tat与LTR-Luc浓度均为0.1 μg/μl，二者按一定配比共同稀释入Opti-MEM培养液。B：Lipofectamine的稀释：用Opti-MEM根据需要稀释后于室温放置5 min。C：将制备好的A液与B液混合，缓缓抽打混匀，室温放置20 min。D：将C液缓缓加入待转染HeLa细胞中，混均，孵育4～6 h。E