HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞系LM9的建立及其生物学特性测定论文.docVIP

　　HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞系LM9的建立及其生物学特性测定论文 .freelent of hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase-genedefect osteosarma cell lineage and assessment of its biological characteristics 【Abstract】 Objective To establish the HGPRT-defect osteosara cell lineage，and determine the ability of saragenesis and fusion.Methods N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG) utation of an osteosara cell lineage(LM8)，then culturing mixed orphous and cell cycles biology inoculated into mice and their groice.Results The LM9 cell lineage has typical characteristics of osteosara cells and it is saragenic to C3h mice.Conclusion The LM9 cells lineage ethod of mutation， it is typical of osteosara cells characteristics and has a prospect of being used in tumor vaccine and other researches. 【Key l/L小牛血清的RPMI 1640完全培养液放在37℃，50ml/L CO2孵箱中培养，对数生长期时，用2.5mg/L的胰酶（含2mg/L的EDTA）消化、离心、调整细胞数后传代、接种。 1.1.2 动物及饲养 4～6周龄C3h鼠8只（第四军医大学实验动物中心提供），雌性，体重17～25g。 1.2 方法 1.2.1 致突变及筛选 LM8系细胞取对数生长期1.0×106/瓶，单层，培养基为RPMI 1640，向瓶中加入2μg/ml的MNNG完全培养液作用15h后，除去致突变液，用PBS冲洗，胰蛋白酶(0.05%)+EDTA(0.02%)1:1混合消化，制备细胞悬液，接种1×103/瓶，培养10天，细胞生长汇合后，传代，以3×103数/瓶密度继续接种，24h后，向培养液中加10μg/ml的8-AG培养液，培养24h待细胞汇合，传代，更换不含8-AG的筛选液培养基继续培养，细胞接近半汇合时，冻存。 1.2.2 突变细胞系LM9鉴定 取对数生长期细胞LM8和LM9接种于培养瓶中，次日加入1% HAT完全营养筛选液，用倒置显微镜观察细胞的生长情况。 细胞形态观察：收集对数生长期细胞0.01M的PBS洗2次2000rpm×10min离心收集细胞，弃上清，以4%的pH7.4的戊二醛固定，按电镜标本常规制备方法，进一步固定，包埋，超薄切片，铅-铀染色JEM-2000型投射电镜观察。 1.2.3 细胞生长特征 调整突变细胞浓度按1×104接种于24孔板，置37．5℃ 5%孵箱培养，每个样品重复3次，连续计数8天，以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞的生长曲线。 1.2.4 流式细胞仪分析细胞周期测定 培养细胞以0.1M PBS液(pH7.4)洗2次，悬溶于190μg结合缓冲液中调整细胞浓度为1×106/ml，加10μl异硫氰酸荧光素(PTIC)标记的连接素(Amexin)和10μl的20mg/L的普匹碘氨（PI），混合均匀，避光室温孵育10min，结合缓冲液洗1次后用 Couter Elite流式细胞仪（Coulter 公司）进行分析细胞周期情况。 1.2.5 体内致瘤性观察 调整细胞浓度为5×105接种于10只小鼠右下肢皮下待皮下出新肿瘤结节时，按文献［3］测量肿瘤大小并观察动物存活情况。 2 结果 2.1 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞筛选 培养瓶中细胞经突变筛选后细胞呈明显多角形态，细胞个体大而丰满、整齐，有个别巨大的细胞，可见有核分裂相，细胞生长良好。 2.2 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞形态特征 光镜下培养的细胞为多角形，核大可见分裂相，相差显微镜下细胞形态呈上皮样排列，生长的单层细胞有重叠生长的能力，细胞成圆形或椭圆形，核大，胞浆深染，且相对较少，核1～2个，细胞异型性明显，核丝分裂偶见，细胞呈弥散分布，组织属恶性肿瘤（图1）。 图1 细胞成圆形或椭圆形，核大，胞浆