RGS4在HUEVCs凋亡中的作用及地塞米松对其的影响论文.docVIP

　　RGS4在HUEVCs凋亡中的作用及地塞米松对其的影响论文 陈星云，赵艳，李平，熊仁，刘苹，杨楠，周元国 【摘要】 目的 研究RGS4对常氧和低氧培养条件下HUEVC细胞凋亡的影响及地塞米松在其中的作用，以探讨RGS4在HUEVC细胞凋亡中的作用及地塞米松处理对其的影响。方法 采用O2/N2/CO2三气培养箱模拟常氧和低氧条件培养HUEVC细胞.freeloxia or hypoxia and the effect of dexamethasone on it.Methods HUEVCs ulated normoxia or hypoxia of O2/N2/CO2 cell incubator and eter (Annexin-V-FITC-PI) ent of dexamethasone had no obvious effect on the apoptosis in normoxia ethasone and e time sho that treated oxia but it can inhibit the apoptosis of HUEVCs in hypoxia; the effect of dexamethasone on the apoptosis of HUEVCs is probably related to RGS4,.freelethasone employ the same cell signaling pathethasone RGS4 急性肺损伤是肺脏炎症和肺微血管通透性增加的急性、进行性呼吸衰竭，其最终阶段即急性呼吸窘迫综合征。血管内皮细胞是连续性衬在血管腔内面，参与体内许多生理和病理生理过程，如维持血管完整性、分泌和释放活性物质、维持血管张力等。在急性肺损伤过程中，肺微血管的变化尤为引人注目，内皮细胞受损被认为是急性肺损伤发生、发展的病理基础。国内外多项研究表明［1～4］，急性肺损伤时内皮细胞发生凋亡，从而导致肺血管内皮－上皮屏障受到破坏，导致血管通透性增加，引起肺水肿和气体交换障碍，地塞米松可以抑制血管内皮细胞的凋亡［6，7］，减轻肺损伤。 本研究拟采用HUEVC内皮细胞株，采用常氧和低氧培养，观察RGS4表达质粒转染后皮细胞凋亡和地塞米松处理后内皮细胞凋亡的变化，以阐明RGS4在内皮细胞凋亡中的作用以及地塞米松处理对其的影响。 1 资料与方法 1.1 主要试剂 质粒：RGS4 in pcDNA3.1(+)(RGS0400000，GUTHRIE cDNA Resource Center，美国)，pcDNA3.1(+)，质粒大量抽提试剂盒(E.Z.N.A. Plasmid Maxiprep Kit， Omega)，Lifofectamin Plus TM Reagent(Invitrogen，美国)。 1.2 实验分组及指标检测时相点 （1）常氧实验分组：1) 空白对照组：(control N1)；2) pcDNA3.1(+)组：(转染pcDNA3.1(+)空质粒，cotrol N2)；3) RGS4转染组：(转染RGS4表达质粒，RGS4N)；4)RGS4转染＋地塞米松处理组(RGS4＋DEX N)；（2）低氧实验分组(1％O2／5％CO2／94 N2％)：1) 空白对照组：(control H1)；2) pcDNA3.1(+)组：(转染pcDNA3.1(+)空质粒，cotrol H2)；3) RGS4转染组：(转染RGS4表达质粒，RGS4H)；4) RGS4转染＋地塞米松处理组(10－7M )(RGS4＋DEX H)（3）检测时相点：流式细胞仪检测细胞凋亡分别于低氧处理后6小时、24小时和48小时测定。 1.3 RGS4以及pcDNA3.1(+)质粒的扩增与提取 常规方法扩增RGS4与pcDNA3.1(+)质粒并采用质粒提取试剂盒提取质粒以用于转染 1.4 HUEVC细胞的培养 取液氮中冻存的HUEVC细胞株，迅速放入40℃水浴中，快速溶解细胞。超净工作台内将细胞悬液移入离涯管中，滴加DMEM培养基至8毫升，洗涤细胞。2000转、离心5分钟、弃上清，用DEME再次洗涤沉淀。沉淀用DEME培养基＋小牛血清悬浮+3%内皮细胞生长因子，移入到细胞培养瓶中培养备用。 1.5 质粒转染(Lipofectamine plus法) 细胞接种，6孔板常规接种2×105细胞/每孔；待细胞贴壁，长至培养板的60%～70％开始转染；质粒转染按Lipofectamine plus 说明书进行。转染24小时后加入G418筛选(1000μg/ml)，直至筛选出可稳定表达的阳性细胞克隆。 1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 1.6.1 在细胞培养瓶内培养未转染细胞和质粒转染后筛选出