5.发光分析.ppt

发光分析法; Molecular fluorescence spectroscopy ;概述;荧光分析法的特点;分子的激发与失活 1. 分子的多重态 单重态 一个所有电子自旋都配对的分子的电子状态。大多数有机物分子的基态是单重态。当基态一对电子中的一个被激发到较高能级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。 三重态 有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能量较激发单重态低。 ;分子荧光和磷光的产主;1. 激发;激发态分子的去活化过程;振动弛豫;内转换;荧光发射;外转换;系间跨越;磷光发射;荧光强度及影响荧光的因素 荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度（F）与荧光物质的吸光强度Ia及其荧光物质的荧光效率φ成正比。 ;根据朗伯-比尔定律荧光的辐射功率IL在与所吸收的功率（Io-I）成正比(入射光功率Io，透过光功率I)Ia=I0-I=I0(1-10-εbc);荧光参数;荧光强度;发射光谱(荧光光谱);荧光量子产率?;荧光寿命;荧光光谱的特征;荧光光谱的特征;蒽的荧光光谱和吸收光谱;分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构（?-?*或n-?*跃迁的物质），才能吸收激发光； 吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率? 。 ? =发射的光量子数/吸收的光量子数 =kf / （kf+ ?ki） ;荧光和分子结构的关系;共轭效应对荧光强度、荧光波长的影响;刚性平面结构;取代基效应;影响荧光强度的因素;溶剂效应 溶剂在激发光谱范围内无吸收. 纯度高.增大溶剂的极性，导致荧光增强，荧光峰红移;温度对荧光强度的影响;溶液pH值对荧光强度的影响;内滤光作用和自吸收现象;粘度;荧光猝灭 荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭;碰撞猝灭;猝灭常数K;静态猝灭;转入三重态的猝灭;电子转移反应的猝灭;荧光物质的自猝灭;分子荧光分析法的特点;荧光分析法的弱点;某些无机物的荧光测定法;烬栋婪瓤昧痈梧倘雍业瞒堵碍激船眯限亦仆点刺嘘渣沾苇蚤襄颓许痘宰访5.发光分析5.发光分析;荧光法测定维生素B2片剂中核黄素含量;样品测定 取一片维生素B2，置于50mL小烧杯中，加入约12 mL醋酸溶液(5 %)，用玻棒捣碎药片，水浴上加热使样品完全溶解，并由混浊变为基本透明后，取下冷却，转入50 mL容量瓶中，用pH6-7溶液稀释至刻度，摇匀。取数mL于离心管中进行离心，用移液管准确移取一定量的上层清液于25 mL比色管中，再用上述pH溶液稀释至刻度, 摇匀制成试液。在与标准曲线一致的实验条件下测定试液的荧光强度，在工作曲线上查出核黄素的浓度并根据样品取样量和稀释倍数，计算出一片维生素B2中核黄素的含量(mg/片)。 ;荧光试剂与荧光探针;NDA可以与谷胱甘肽（GSH）生成强荧光物质，而无需亲核试剂（CN-）的参与，激发波长 472 nm，发射波长 528 nm;Molecular Beacons分子灯（MB）  Novel Fluorescent DNA Probes; DNA – Genetic Info Carrier;Background: 通常的DNA针探;1.目标基因和探针混合,并固定在固体表面2. 通过洗涤,除去为以氢键形成嘌呤-嘧啶配对的多余探针;Conventional DNA Probes;Novel DNA Probes: Introduction;Molecular Beacons: Principles;原理 Two Forms of Energy Transfer;腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G），胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）4种。 Complementary base pairing: G—C , A—T;Direct Energy Transfer —dominant;Advantages of MB Probes;Advantages: High Specificity;Synthesis of Molecular Beacons;Synthesis Procedures;Synthesis Step 1: Coupling of a quencher;Synthesis  Step 1: Coupling of a quencher;Synthesis Step 1. Coupling of a quencher;Synthesis  Step 2. Coupling of a Fluorophore;Synthesis  Step 2. Coupling of a Fluorophore;An applic