人脐带间质干细胞分离纯化及基本生物学特性研究论文.docVIP

　　人脐带间质干细胞分离纯化及基本生物学特性研究论文 .freelethod of human umbilical cord derived mes-enchymal stem cells （UCMSC）. MethodsThe umbilical cords from cesarean neal stem cells e digest method and cultured in DMEM/F12 medium. Surface antigens of UCMSC ethods. After 12-14 days of primary culture， isolated MSCs reached 90% confluence and the cells could expand at least 20 passages. FACS analysis shobilical cord derived MSCs has strong proliferation capacity， bilical cord; mesenchymal stem cell; biology;cell separation 间质干细胞（MSC）是最早由FRIEDENSTEIN发现，存在于骨髓中的一类成体干细胞，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞，是细胞工程重要的种子细胞之一［1］。近年来，国内外多个实验组报道了骨髓MSC（BMMSC）体外特定条件下能转化为神经元样细胞，使BMMSC受到了越来越多的关注［2］。但在临床上，骨髓取材较困难，供体有限，随年龄增长BMMSC增殖能力、多向分化能力下降，且有病毒污染的可能［3］。这些限制了BMMSC的进一步临床应用。寻找其他来源的MSC成为近年来的研究热点。新近有研究报道MSC不仅存在于骨髓，还存在于外周血，尤其是脐带血，更有研究报道从胎儿肝脏、肺脏、肾脏等部位提取到了MSC［4］，表明MSC 不仅存在于血液系统，也存在于实质组织内。但脐带血MSC含量稀少，分离极其困难，胎儿MSC的应用则受到伦理学的限制。脐带血及胎儿内脏均存在MSC，脐带作为新生儿的一部分并且是分娩废弃物，其中是否也含有并能否提取到足量的MSC引起本研究室的关注。本文拟探讨从脐带获取MSC的方法及其基本生物学特性。 1 材料和方法 1.1 材料 脐带组织取自天津市中心妇产医院剖宫产足月新生儿，均经父母授权同意。主要试剂和诱导剂:DMEM/F12培养液（Hyclone公司）、胎牛血清（Fe-talbovineserum，中国医学科学研究院血液病研究所）、碘化丙啶（BD公司）、胶原酶Ⅳ（Sigma公司）、BrdU（Sigma公司）、兔抗人BrdU抗体（北京中杉生物技术公司）、SP试剂盒（北京中杉生物技术公司）、流式抗体（除FITC-CD105购自Ancell公司，其余均购自美国BD公司）。RT-PCR试剂购自Invitro-gen公司，引物由上海博亚生物公司合成。 1.2 脐带MSC的分离 采用了两种脐带MSC的分离方法，分别是组织块贴壁法和胶原酶消化法。 1.2.1组织块贴壁法 将脐带从手术台上取下，无菌条件下浸入DMEM/F12培养液中，4 ℃保存，超净台内取出脐带，PBS冲洗，冲去脐静脉及动脉内的残存血。将脐带剪碎至1 mm3 大小组织块。组织块接种于含DMEM/F12培养液（含体积分数为0.1的FBS，25 mmol/L谷氨酰胺，105U/L青霉素，100 mg/L链霉素）50 mL的塑料培养皿中，放置于37 ℃、体积分数0.05的CO2 饱和湿度的孵箱内培养。1周后，去掉组织块更换培养液。以后每 3 d 换液1次。细胞长到80%融合时，用2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L的EDTA混合液消化（在显微镜下控制消化时间），以8.0×103 /cm2 的密度接种于传代培养瓶（T-25）中进行扩增培养。 1.2.2胶原酶消化法 开始同组织块贴壁法，脐带剪碎至1 mm3 大小组织块后转移至1 g/L胶原酶Ⅳ中，37 ℃持续搅拌消化30 min，随即用1 g/L胰酶37 ℃持续搅拌消化30 min。细胞筛过滤，滤液离心，PBS洗2次。以1.0×106 /cm2 的密度接种于含DMEM/F12培养液（含体积分数为0.1的FBS，25 mmol/L谷氨酰胺，105U/L青霉素， 100 mg/ L链霉素）的T-25塑料培养瓶中。3～4 d后更换培养液，去掉未贴壁细胞。以后每3 d换液1次，至细胞融合传代。 1.3 细胞表面分子标志检测 分别取第3、5、10代的脐带MSC，去掉培养液，PBS洗2次，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，PBS洗涤后制成浓度为3.0×109 /L的单细胞悬液