CD59siRNA对人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤的作用论文.docVIP

　　CD59siRNA对人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤的作用论文 【摘要】 目的 探讨针对CD59的siRNA(CD59siRNA)对人卵巢癌裸鼠移植瘤CD59的沉默效应及其抑瘤作用。方法 采用脂质体转染法将CD59干扰质粒(T组)和空质粒(V组)转染A2780细胞，获得稳定表达细胞株，将T组、V组A2780细胞和未转染(C组)的A2780细胞分别接种于裸鼠皮下建立肿瘤模型，通过绘制肿瘤生长曲线、RTPCR和免疫组织化学法研究其抑瘤效应和对CD59基因及蛋白的沉默效应。结果 与V组和C组比较，T组肿瘤体积和质量明显减小(F=301.88、5.39,q=4.01～30.41,P 0.05)，CD59基因及蛋白表达减少(F=817.77、247.71,q=26.59～52.25,P 0.05)。结论 特异性沉默CD59基因的siRNA表达载体可以明显抑制CD59的表达及卵巢癌在体内的生长。 【关键词】 抗原,CD59;卵巢肿瘤;RNA干扰;小鼠，裸 ABSTRACT Objective To investigate the inhibition effect of CD59siRNA on CD59 gene and the groice. Methods A2780 cells id (group T) and blank plasmid (group V), respectively, using Lipofectamne 2000. These cells and A2780 cells ice. The inhibition effect of CD59siRNA on tumor and the expreesion of CD59 or gromunohistochemistry (IHC). Results pared or volume and RNA and CD59 also decreased (F=817.77,247.71;q=26.59-52.25;P 0.05). Conclusion CD59siRNA can significantly suppress the expression of CD59 and gros; RNA interference; mice, nude CD59是一种广泛分布于组织细胞表面的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚固糖蛋白，具有多种重要的免疫功能,其最重要的功能是作为补体系统终末阶段的调节蛋白.freelCRPs)，使肿瘤细胞逃脱了自身的免疫监视4，与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关5，同时也是导致众多肿瘤治疗失败的重要原因。本课题组前期利用RNA干扰技术(RNAi)构建了针对CD59的pSUPERCD59siRNA重组载体67，并在体外实验证明了其对CD59的沉默效应。为深入了解CD59基因表达变化对肿瘤细胞在体内生长的影响，本研究利用该重组载体，观察其在荷瘤裸鼠体内对肿瘤细胞CD59基因的沉默及抑瘤效应，为肿瘤基因治疗提供动物实验依据。 1 材料和方法 1.1 材料 人卵巢癌细胞系A2780细胞由本实验室保存;小鼠抗人CD59抗体购自BD Pharmingen公司;Lipofectamne 2000和总RNA提取试剂盒均购自Invitrogen公司;4～6周龄雌性裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司;pSUPER质粒由我院罗兵教授惠赠; 重组质粒pSUPERCD59siRNA由本室构建和保存;Access RTPCR A1250试剂盒购自Promega公司;DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥公司;SABC免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞转染及稳定转染细胞克隆的筛选 用 2.5 g/L胰酶消化生长状态良好的A2780细胞，调整细胞密度达2×108/L,取0.5 mL加入24孔细胞培养板过夜培养，待细胞达到80%～90%汇合时进行转染。利用脂质体Lipofectamne 2000，将pSUPERCD59siRNA及空质粒pSUPER分别转染A2780细胞。G418选择性培养基中筛选具有抗性的单细胞来源的细胞克隆,扩大培养。将筛选出的干扰质粒整合的细胞克隆作为干扰组(T组)，空质粒整合的细胞克隆为阴性对照组(V组)，未转染的A2780细胞为空白对照组(C组)。 1.2.2 移植瘤裸鼠模型的建立 4～6周龄雌性裸鼠饲养在SPF环境中, 随机分为3组(T组、V组和C组)，每组6只。采用常规培养细胞种植法，收集处于对数生长期的各组A2780细胞，于相应组每只裸鼠右腋皮下注射细胞5×106个(0.2 mL)。连续观察30 d，记录肿瘤出现的时间;并于接种后每5 d测量肿瘤的长轴(L)和短轴(S 1