CHO细胞表面与人CD59结合的活性短肽序列的筛选论文.docVIP

　　CHO细胞表面与人CD59结合的活性短肽序列的筛选论文 【摘要】 目的 筛选获得高表达人CD59中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表面与人CD59特异性结合的短肽序列，为下一步研究与肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供实验依据。方法 以离子层析柱纯化的CHO细胞的裂解蛋白纯蛋白为靶分子分别进行5轮亲和筛选，并进行竞争结合实验，双夹心ELISA方法鉴定噬菌体阳性克隆。提取阳性单克隆单链DNA测序，并推导出短肽序列。结果 随机挑选的16个单克隆中有10个克隆对CHO细胞纯蛋白有特异性结合力，经测序得到两条高度同源的多肽序列。结论 通过噬菌体随机肽库对CHO细胞进行纯蛋白筛选得到了能与人CD59特异性结合的短肽序列。 【关键词】 噬菌体肽库 蛋白质CD59 短肽封条 ［ABSTRACT］ObjectiveTo screen the sequence of short active peptide binding to human CD59 of the surface of CHO cell, and provide an experimental basis for designing an tumorsneakingthroughrelated active shortpeptide medicine of CD59. MethodsTaking CHO cells protein as target cells by ionexchange chromatograph，a fiveround affinity screening ly．After a petitive test, positive phage clones peptide library. ［KEY 13Ⅷ蛋白单克隆抗体购于Pharmacia公司。 1.2 方法 1.2.1 酶标板的包被与封闭 使用0.1 mol/L的NaHCO3(pH 8.6)缓冲液分别将纯化蛋白稀释为100 mg/L、50 mg/L两种浓度，各取100 μL加入到酶标孔底部（100 mg/L包一个板，50 mg/L包3个板），4 ℃过夜。次日弃去包被液，加入以 0.1 mol/L的NaHCO3缓冲液(pH 8.6)配制的体积分数0.01的BSA溶液150 μL，4 ℃封闭1 h。之后用PBST溶液洗板6次，备用。 1.2.2 噬菌体肽库的筛选 首先取一个浓度为100 mg/L的板，在包被孔中加入50 μL自扩增肽库（用50 μL的TBST稀释），室温振摇45 min，弃去未结合的噬菌体，再用TBST洗10次，加入100 μL pH 2.2的甘氨酸洗脱液于室温作用10 min,并不时振荡，加入15 μL的Tris中和，收集洗脱液后，计数、扩增，用于第2轮筛选。后4轮筛选包被浓度均为50 mg/L，提纯噬菌体。5轮筛选结束后，测定滴度并在IPTG/Xgal琼脂板上随机挑取16个蓝色噬斑进行大量扩增提纯。 1.3 可结合噬菌体肽库克隆的鉴定 用CHO细胞裂解蛋白纯化蛋白(每孔50 μL，加50 μL包被液)包被酶联板，4 ℃孵育过夜。用1 g/L牛血清清蛋白（BSA）封闭后，将50 μL噬菌体肽库加入到包被纯化蛋白和仅包被碳酸盐缓冲液的孔中，37 ℃作用1 h，后以1∶100鼠源性M13Ⅷ单抗37 ℃作用1 h，1∶2 000 HRP羊抗鼠抗体37 ℃作用1 h，以OPD底物显色后，最后测定波长490 nm处吸光度（A）值。以包被碳酸盐缓冲液为阴性对照。 1.4 与野生型噬菌体M13的竞争结合实验 将第2、3、4、5轮筛选扩增后的噬菌体及随机挑选扩增后的10个噬菌体分别与野生型M13噬菌体以1∶1的比例混合,加入到已包被CHO细胞纯化蛋白的酶标板中进行前述洗脱筛选裂解过程。 1.5 DNA序列测定 扩增并按NEB试剂盒纯化阳性噬菌体克隆，抽提单链DNA，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。使用NEB公司提供的测序引物送上海生工生物公司全自动测序。 2 结 果 2.1 十二肽库筛选 在5轮筛选中,逐轮缩短与靶蛋白的作用时间，筛选结果回收率逐轮提高，显示出较好的富集效果，但第4轮过后回收率并未呈现数量级的增加，甚至略为降低。见表1。表1 高表达人CD59的CHO细胞的筛选 2.2 与野生型M13噬菌体竞争结合实验 将10个随机挑选的单克隆和4轮筛选后的噬菌体库分别与野生型M13噬菌体进行竞争结合实验，1～10号单克隆的结合力分别为：20、25、23、30、26、27、22、25、28、31；4轮筛选后的噬菌体库的结合力分别为：3、10、25、29，呈逐渐增高的趋势，但第4、5轮之间差异不大。 2.3 噬菌体克隆与人CD59