HPV18 E6E7反义荧光真核表达载体的构建及其在宫颈癌HeLa细胞中的表达论文.docVIP

　　HPV18 E6E7反义荧光真核表达载体的构建及其在宫颈癌HeLa细胞中的表达论文 司马妮，王薇，田训，罗爱月，李春晓，王娟，卢运萍，王世宣.freelRNA和蛋白的表达。结果 成功构建HPV18 E6E7反义荧光真核表达载体EGFP18AS，经脂质体转染HeLa细胞，48h后在荧光倒置显微镜下可见明显的绿色荧光，且细胞中E6、E7 mRNA及蛋白表达水平均明显下调。结论 反义荧光真核表达载体可以有效的抑制HPV18 E6、E7癌基因的表达，为治疗HPV感染和宫颈癌提供了一种新的方法。 【关键词】 人乳头瘤病毒18型；E6/E7；反义；EGFP；宫颈癌 宫颈癌是妇女常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内，其发病率仅次于乳腺癌，但在广大发展中国家其发病率居首位，约占女性恶性肿瘤总数的25%1。研究表明，99%的宫颈癌组织中可检出人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)，尤其是16、18型等高危型HPV与宫颈癌发生关系密切。现已证实高危型HPV早期蛋白中的E6和E7为宫颈上皮恶性转化中的关键蛋白，因此针对E6、E7基因为靶点的治疗手段成为我们研究的重点。反义技术是近年来兴起的一种基因治疗技术，该技术可以高效、特异的阻断目的基因的表达。因此利用反义技术从基因水平封闭病毒癌基因E6、E7，有望成为宫颈癌基因治疗的有效途径2。本研究成功构建了可表达HPV18的E6、E7反义RAN的荧光真核表达载体，经脂质体转染宫颈癌HeLa细胞株，观测其对于HPV18 E6/E7 mRNA及蛋白表达的影响，为临床HPV感染及宫颈癌治疗探索新的方法。 1 材料与方法 1.1 载体、菌株和细胞株 含有HPV18标准全长基因的质粒由德国海德堡大学EthelMichele de Villiers教授惠赠。真核表达载体pEGFPC1购自Clontech公司。HeLa细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），大肠杆菌株DH5α由本室保存。 1.2 引物和测序 扩增HPV18E6E7基因片段的引物：P1 5 TAA TCG ATA TAA TCC AAC ACG GCG ACC C 3，P2 5 GGG ATC GAT GGC TTT CTA CTA CTA GCT CAA T 3。检测HPV18的E6基因的引物：P1 5 GGC GAC CCT ACA AGC TAC CTG A 3，P2 5 TTC TCT GCG TCG TTG GAG TCG TTC 3。检测HPV18的E7基因的引物：P1 5 AAG CGA CTC AGA GGA AGA 3，P2 5 CAC AAA GGA CAG GGT GTT 3。内参照βactin的引物：P1 5AGC CAT GTA CGT TGC TAT CC3，P2 5TTG GCG TAC AGG TCT TTG C3。内参照GAPDH的引物：P1 5GGA GCC AAA AGG GTC ATC A3，P2 5GCC ATC ACG CCA CAG TTT C3。5个PCR扩增产物长度分别为716、440、199、498、255bp。上述所有引物的合成和测序工作均由上海英骏生物技术有限公司完成。 1.3 主要试剂 RNA提取试剂TRIzol和细胞培养基DMEM购自Gibco公司，Taq DNA聚合酶和T4连接酶为MBI公司产品，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，逆转录酶MMLV购自Promega公司，限制性内切酶EcoR I为TaKaRa公司产品。HPV16/18 E6抗体（sc460）、HPV18 E7抗体（SC1590）和βactin抗体（sc1616R）购自Santa Cruz公司。ECL试剂盒购自Pierce公司。 1.4 载体构建和鉴定 以含有HPV18全长基因组的质粒为模板，行PCR扩增HPV18E6E7基因片段，条件如下：95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 60s，35个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下拍照。PCR产物连接T载体，蓝白斑筛后EcoR I酶切获得目的片段，然后将其与经EcoR I酶切线性化的pEGFPC1 16℃连接。连接产物转化DH5α菌株，挑取单克隆，酶切和测序鉴定。将测序为反向构建成功的质粒命名为pEGFPHPV18E6E7as（EGFP18AS）。 1.5 细胞培养和转染 用EGFP18AS和pEGFP（对照质粒）分别经Lipofectamine 2000转染HeLa细胞后继续培养，6～8h后开始在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光并评估其转染效率。 1.6 RTPCR检测 转染后48h分别用TRIzol试剂提取转染EGFP18AS、pEGFP的S