HPV感染阳性角朊细胞的原代培养及生物学特性研究论文.docVIP

　　HPV感染阳性角朊细胞的原代培养及生物学特性研究论文 .freelavirus，human;keratinocytes;cells，cul-ture;biologiccharacters Abstract:AIMToinvestigatethebiologiccharactersofHPVpositivekeratinocytesinculture.METHODSBypro-tectingthecellgroalkeratinocytes（NK）.HPVpositivekeratinocytesedbyPCRandDNAhybridization.RESULTSPKproliferatedmorequicklythanNK，andgreidiumbutdidnotformclone.CONCLUSIONPKgreidiuminmunocellgroalmodelforHPVinfection. 0引言 人乳头瘤病毒（HPV）是一种常常感染复层上皮细胞，并引起乳头瘤样改变及良、恶性肿瘤的小DNA病毒，其中常见的HPV16，18，30，31，42，51～54等9型与恶性肿瘤相关，其治疗和预防有重要意义，传统的治疗方法复发率甚高，目前最有希望的疗法是主动免疫治疗.我们培养HPV感染阳性角朊细胞，初步研究其生物学特性. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1试剂RPMI1640培养基为美国Gibco公司产品，胎牛血清购自华美生物工程公司.鼠尾胶原按Montesano等［1］所述方法制得.新鲜成年SD大鼠鼠尾，在700mL L-1乙醇中浸泡20min后抽出鼠尾胶丝，剪碎浸入4℃，5mL L-1的无菌乙酸溶液中混匀48h，（150mL/tail），胶原溶液在4℃，10000g离心15min，用5mL L-1的乙酸溶液将胶原浓度调整至3g L-1，终浓度用BeckmanDu640紫外分光度仪测定.培养液中氯化钙的终浓度为0.04mmol L-1. 1.1.2HPV感染阳性角朊细胞来自1例20岁男性尖锐湿疣患者包皮部位病损和1例22岁女性阴道前壁病损患者.正常人表皮角朊细胞来自门诊2例单纯包茎患者环切术后包皮内外板皮肤. 1.2方法 1.2.1细胞培养胰酶消化法分别获得患者疣体部位及正常部位角朊细胞，以1×105细胞数接种于涂布鼠尾胶原的100mL细胞培养瓶，培养条件为50mL L-1CO2，37℃.培养基为RPMI1640培养液含水量100mL L-1小牛血清和抗菌素（青霉素0.1μ L-1，链霉素0.1μ L-1）. 1.2.2计数法绘制细胞生长曲线实验分组，以下测量参数，来源于男性的HPV阳性角朊细胞为HPVPKCm组，来源于女性的为HPVPKCf组，正常人角朊细胞分别为HPVNKCm和HPVPNKCf组.用2.5g L-1胰酶消化第3代单层培养的角朊细胞，用培养液制成单细胞悬液，阳性组每孔4×104个细胞、阴性组每孔8×104个细胞接种于24孔板，每孔加入1mL培养液.常规培养，3d换液1次，每3d测量1次，每次3个复孔，连续24d，计数方法为2.5g L-1胰酶消化后于镜下用血小板计数器计数，所得数据用MicrocalOrigin软件绘制细胞生长曲线. 1.2.3形态学观察及特性检测①倒置显微镜进行动态观察或爬片、涂片染色后观察;②原位杂交HPV地高辛标记的DNA探针（博士得，MK1040），用于检测HPV感染阳性的培养角朊细胞，阳性对照为西京医院病理科HPV阳性患者病理切片，阴性对照为正常人皮肤切片，方法依照试剂盒说明;③软琼脂培养35mm培养皿（NUNC，丹麦）5个，琼脂糖（Agarose，PromegaV312A）7g L-1（底层）和3.5g L-1（表层），接种培养细胞1000个每皿，每10d观察细胞克隆数，共40d;④PCR检测HPV11，16通用引物为MY09和MY11［2］.HPV11，16的特异性引物根据Oligo软件设计，由上海生物工程公司合成.模板DNA是HPV感染阳性的培养角朊细胞提取物.PCR参数:94℃，50℃和72℃，各30s，25个循环.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，与Mark对比. 2结果 HPVPKC组原代培养初期，在低倍镜下，基底细胞游离在培养液中，呈透明小圆细胞，培养液中还可见有棘细胞及角质细胞，低倍镜下为不透明的细胞及扁平细胞，培养5d后，基底细胞开始占优势.传代接种于24孔板，每个孔中接种细胞数为4×104，于接种后18～24h即可见细胞贴壁，并聚集成大小不等到集落.在其边缘部见新生的角朊细胞逐渐向外周呈单层生长，在培养皿的周边部分细胞较致密.至接种后8～10dPK角朊细胞联接成片，铺满培养皿.而H