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　　Humanin的基因克隆及序列测定论文 靳辉，王唯析，杨广笑，王全颖，胡海涛，韩太真 【关键词】 阿尔茨海默病 作者简介：靳辉(1973)，女(汉族),解剖学硕士. 研究方向：阿尔茨海默病的病理机制及防治. 摘要：目的 利用基因工程方法对Humanin进行基因克隆并测定其序列，为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗奠定基础。方法 采用非对称互补引物/模板法.freelanin的cDNA，将其克隆入pVAXI载体中并测序。结果 经酶切鉴定、测序分析，表明所插入的基因片断为Humanin基因，与设计完全相同。结论 成功地克隆了Humanin基因。 关键词：阿尔茨海默病；Humanin；基因克隆；序列测定 ABSTRACT: Objective To use gene engineering technique to clone and sequence theHumanin. Methods By means of asymmetrical primer/template, double stranded cDNA of Humanin es sites on the tes. Then the cDNA id pVAXI and sequenced. Results Evidences of DNA sequence analysis and restriction enzymes digestion shoent anin cDNA, consistent ent anin cDNA ers disease; Humanin; gene cloning; sequencing 阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)是以进行性的记忆减退、认知障碍和痴呆为临床表现的老年人常见疾病，发病率随着人口的老龄化而迅速增加，已成为继心血管疾病、癌症和中风之后的又一严重危害人类健康的疾病。目前世界各国均在积极寻找防治AD的有效措施。近年，日本学者首先从AD患者未发病的大脑枕叶分离出一种称为Humanin(HN)的短肽。它能有效抑制AD相关基因：淀粉样蛋白前体(amyloid precursor, APP)基因、早老素1(presenilin1, PS1)基因、早老素2(presenilin2, PS2)基因的突变，以及β淀粉样肽(amyloid peptide, Aβ)引起的神经细胞死亡，且Humanin的一种衍生物――Humanin(HNG)，被证实作用较HN强1000倍。迄今，Humanin及其衍生物的作用机制仍不十分清楚。为了深入研究其对AD的作用机制以及为开发新的更为有效的抗AD药物提供参考，我们首次在国内对HNG进行基因克隆。 1 材料与方法 1.1 材料 大肠杆菌E.coli DH5α、质粒载体pVAXI 由西安华广生物工程公司提供。限制性内切酶KpnⅠ、XhoⅠ、SalⅠ及T4 DNA连接酶，均购自华美生物工程公司。 1.2 HNG DNA 的设计与合成 根据Hashimoto等人提供的HN基因序列，将其第14位丝氨酸碱基AGT换为甘氨酸碱基GGG，形成HNG基因序列，在其前后分别加入质粒载体pVAXI多克隆位点上的两个单一酶切位点KpnⅠ和XhoⅠ，并在HNG基因编码区的下游引入了一个载体上没有的酶切位点SalⅠ。设计HNG非全长、部分互补的两条单链DNA，使其互为引物、互为模板制备全长HNG cDNA。序列如下：正链：CGGTACCATGGCTCCACGAGGGTTCAGCTGTCTCTTACTTTTAACCGGGGAAATTG；负链：GCCTCGAGCGTCGACTGCCCGCCTCTTCACGGGCAGGTCAATTTCCCCGG(正链中GGTACC为KpnⅠ酶切位点，GGG为第14位甘氨酸的编码碱基；负链中CTCGAG、GTCGAC分别为XhoⅠ、SalⅠ酶切位点；下划线部分为12个互补碱基)。以上序列均由上海生物工程有限公司合成，PAGE纯化。 1.3 重组质粒的构建 将上述正负链退火后再以Klenoarker前方，大片段位于λDNA/HindⅢ marker 2322bp与4361bp之间(图2C)，此两片断与理论值81bp及2935bp相符。此6份质粒用SalⅠ消化，可见质粒被线性化，只有一条条带(图2D)，位置与未经酶切的重组质粒(图2E)相近(图2)。图2 pVAXI/HNG重组质粒酶切鉴定图谱（略） 2.3 测序结果 采用电脑DNA分析辅助软件，将上海生物工程有限公司测定的基因序列进行分析，结果发现该序列与设计完全相同。 3 讨 论 HN是一种新近发现的神经保护肽，含24个氨基酸残基(MetAlaProArgGlyPheSerCysLeuLeuLeuLeu