HSP90β基因突变与糖皮质激素治疗敏感性的关系论文.docVIP

　　HSP90β基因突变与糖皮质激素治疗敏感性的关系论文 赵艳，王华，陈星云，季业伟，周元国 【关键词】 热休克蛋白90β；糖皮质激素类；突变 【Abstract】 AIM: To screen the mutation of heat shock protein 90β(HSP90β) gene in patients ary nephrotic syndrome and to investigate the association betutation and the sensitivity to glucocorticoid therapy. METHODS: Extract the blood DNA of the 300 glucocoiticoidtreated primary nephrotic syndrome patients. PCR approach plify intron 9, exon10, intron 10, exon11 and 3 untranslated region of HSP90β, and automated fluorescent sequencing technology utation of the region. RESULTS: Tutations of HSP90β, 7489 C T in intron 10 and 7612 C T in 3 untranslated region ary nephrotic syndrome patients. The mutation frequency of glucocoiticoidsensitive and glucocoiticoidresisted patients ary nephrotic syndrome patients ,but there utation 【摘要】 目的： 筛选肾病综合征患者热休克蛋白90β（heat shock protein 90, HSP90）基因突变,并分析该突变与糖皮质激素治疗敏感性的关系. 方法： 提取300例经糖皮质激素治疗的肾病综合征患者血液DNA，采用聚合酶链反应 (polymerase chain reaction)和自动荧光测序方法, 对HSP90基因intron 9.freelL ,置-20 ℃冻存待检. DNA纯化试剂盒购自Promega公司; Taq 多聚酶购自宝生物公司. 细胞裂解液Ⅰ： 10 mmol/L Tris.Cl, 10 mmol/L KCl, 10 mmol/L MgCl. 细胞裂解液Ⅱ： 10 mmol/L Tris.Cl, 10 mmol/L KCl, 10 mmol/L MgCl2， 0.5 mol/L NaCl, 5 g/L SDS， 2 mmol/L EDTANa2. NP40为Sigma公司产品，酚、氯仿、异戊醇、乙酸钠购自重庆医药股份有限公司. 全自动凝胶成像分析系统（UVP，英国）, PTC100TM PCR 仪 (MJ Research,美国)，全自动基因测序分析仪CEQ8000（BECKMAN COULTER,美国）. 1.2方法 1.2.1基因组DNA 的提取全血DNA的提取采用NP40法. 取500 μL抗凝血于1.5 mL的Eppendorf管,分别加入细胞裂解液Ⅰ和NP40,细胞裂解液Ⅱ裂解后用依次用酚、氯仿抽提，乙酸钠、异戊醇沉淀后可见白色丝状沉淀,乙醇洗涤后溶于TE Buffer，-20℃保存. 用琼脂糖凝胶检查DNA 的完整性及浓度,调整DNA 的浓度至(300~500) ng/μL. 1.2.2引物序列与PCR反应参照Genbank提供的HSP90βDNA序列（Accession No: J04988）和阅读框设计引物,其序列为Sense: 5′ GCCAG CATGG TCTCA AACTC 3′；Antisense: 5′ CATCC AATCC TGCTG TCAAG 3′. 扩增产物为881 bp，扩增区域包括HSP90β基因intron 9,exon10, intron 10, exon11, 3′非编码区域. PCR 反应体系总体积为50 μL. 扩增条件为94℃，5 min, 94℃变性30 s, 60℃退火30 s，72℃延伸1 min , 35个循环后,72℃延伸10 min. 取10 μL加有载样缓冲液的PCR扩增产物加样至15 g/L琼脂糖凝胶中,在电压100 V下电泳30 min后,于全自动凝胶成像分析系统记录结果进行分析. 1.2.3PCR产物的纯化及序列测定PCR 扩增产物的凝胶纯化回收按照Promega公司试剂盒操作说明进行. 纯化回收后使用BECKMAN CE