LacZ DNA 标记的腺病毒在高氧性肺损伤基因治疗中的转染和致炎作用论文.docVIP

　　LacZ DNA 标记的腺病毒在高氧性肺损伤基因治疗中的转染和致炎作用论文 【摘要】 目的观察LacZ DNA 标记的腺病毒在高氧性肺损伤基因治疗中的转染和致炎作用。方法装载LacZ DNA 的腺病毒在小鼠高氧模型开始前2天经鼻腔送入体内，X-gal 染色和β-半乳糖酶活性测定用于确定LacZ DNA在肺内转染的分布及其蛋白表达产物的活性;小鼠肺干/湿重比和支气管肺泡盥洗液(BALF)内的蛋白浓度的测定用于鉴定腺病毒在基因治疗过程中可能存在的致炎作用。结果X-gal 染色显示LacZ DNA在高氧前及后均可广泛转染在肺各级支气管和肺泡上皮细胞，β-半乳糖酶活性的测定提示了LacZ DNA 可成功地翻译成其蛋白质表达产物并表现为高表达;同时，腺病毒的致炎作用在高氧吸入48h后示小鼠肺干/湿重比和BALF蛋白浓度均较其他对照组明显升高，但其升高的程度可在24h后迅速缓解上升趋势。结论腺病毒为载体的基因治疗可有效地转染标记基因，同时，腺病毒虽在基因治疗的过程中有一定的致炎作用，但是暂时的.freelmation of adenovirus marked by LacZ DNA to hyperoxia lung injury in gene therapy. MethodsAdenovirus encoded LacZ DNA inistered to mice at 2 days earlier before 100%O2 inhalation, X-gal staining and activity measurement of β-gal protein translated from LacZ DNA ine the level of LacZ DNA transfer and its protein expression; meanouse lung easured to valuate the degree of inflammation reaction from adenovirus.ResultsX-gal staining shoatter before or after 100%O2 inhalation; β-gal protein activity measurement presented LacZ DNA could successfully translated into its protein expression eanmation of adenovirus shoouse lung e degree of endogenous inflammation, but it is temporarily, it is still a validity vector in gene therapy. Key in，舱内氧气交换频率是6～7次/ h，CO2 0.2%，湿度约45%，并维持约12h的白天黑夜交替。在100% O2吸入后的24、48和72h，分别收集肺组织和肺泡灌洗液等标本以备检测之用。 1.2.3标本的收集和处理在高氧吸入前及后的24、48和72h，应用苯巴比妥(50mg/kg)腹腔深度麻醉小鼠后，暴露小鼠主气管并行气管插管和机械通气。沿胸腹中线切开皮肤和腹部皮下组织以暴露腹腔脏器和腹主动脉。隔断腹主动脉放血以减少肺部血流量，随后，打开胸腔，分离心脏及肺旁结缔组织，并经右心室穿刺，肺泡灌流液以20～30cm H2O(1cm H2O=0.098 kPa)水压经右心室灌流肺组织，至肺组织内血液冲洗干净。分离出的肺组织在液氮中快速冷藏，并将肺标本保存在-80℃的冰箱内以备用。另外，在机械通气后及肺泡灌流之前，用注射器灌洗肺泡3次，并收集支气管-肺泡灌洗液。灌洗后的肺组织经由主气管灌入4%的甲醛溶液至肺泡内以备用于肺组织的细胞化学染色。 1.2.4 X-gal染色β-半乳糖酶(X-gal)染色4 可以提供LacZ DNA整合到肺上皮细胞DNA后的蛋白表达分布的影像学分析。新鲜整体肺组织在福尔马林液内固定并彻底漂洗后，在X-gal复合试剂(K4Fe()6-3H2O，K3Fe()6，2mM MgCl2 and 0.5mg/ml of X-gal)内孵育过夜。次日，PBS漂洗后，观察肺组织X-gal颜色后的蓝色深浅程度及范围并摄片记录。染色后的整体肺组织依次通过10%、20%和30%蔗糖溶液再次固定。随后，将肺组织包埋在OCT 复合物并在液氮中迅速冷冻成型。沿气管纵轴将肺组织切成厚度为10μm的切片;核红试剂复合染色后，可在荧光显微镜下观察摄片(200倍)。 1.2.5β-半乳糖酶活性测定510mg肺组织在0.25mol/L Tris-HCl的均浆缓冲液中快速匀浆。200μl 邻硝基酚半乳糖