miR21在白血病发病过程中的作用研究论文.docVIP

　　miR21在白血病发病过程中的作用研究论文 张帅 王萍玉 尹娟 李有杰 马颖 谢书阳 【摘要】 目的 本实验旨在研究miR21在白血病细胞中表达情况，探讨miR21基因与白血病发病的关系。方法 提取组织中的小于200 bp的RNA,用poly(A)聚合酶在其3′末端加尾，再用5′带40 nt延伸序列的单碱基锚定OligdT引物进行反转录，然后用特异引物进行realtime PCR扩增，从而检测部分miRNAs在白血病细胞株K562中的表达，并与正常人骨髓表达情况相对比。结果 通过realtime PCR 分析，癌基因miR21在K562细胞中的表达量约为(1.73±0.24）×105 个拷贝，明显高于正常人骨髓组织中miR21的表达（P＜0.01）。结论 本研究表明miR21在K562细胞中的表达量增高.freeliR21；白血病；基因表达 【Abstract】 Objective Studing the expression of miR21 in leukemia cells to explore the relationship betiR21 and development of leukemia. Methods After less than 200bp miRNA erase A, the miRNA ers for realtime PCR at 5’ end. Then, the expression of miR21 arroiR21 in K562 cell arroe PCR analysis（P＜0.01）.Conclusion The study demonstrated that the expression of miR21 ia cells,ay play an important role in leukemia development. 【Key e PCR, miR21,leukemia，gene expression MicroRNA (miRNA)是近几年在真核生物中发现的一类具有调控功能的非编码RNA，大小约为21～25个碱基的单链小分子RNA。miRNA能调节生物体生长、发育和疾病发生过程中有关基因的表达［1，2］，推测这种小分子调控人类近1/3的基因，平均每个miRNA可调节人类200种不同的mRNA表达，并且多个miRNA能够协调调节一些特殊的靶基因［3］。研究发现miRNAs在正常血细胞分化过程中发挥着重要作用，因此miRNAs的异常表达可能与血液系统疾病的发生和发展密切相关。 目前，随着生物信息学的发展和靶基因实验的确定，有助于揭示miRNAs在调控正常血细胞分化以及相关血液系统肿瘤中的详细分子机制，miRNAs的检测有望成为某些血液系统肿瘤的诊断方法，miRNAs及其靶基因的表达控制也可能成为治疗某些血液系统肿瘤的手段。本研究旨在应用realtime PCR研究miR21在白血病细胞中表达情况，探讨其与白血病发病的关系。 1 材料与方法 1.1 细胞培养 K562细胞用10%胎牛血清的DMEM培养基，于5%CO2、37 ℃条件下培养。正常人的骨髓细胞由山东省烟台山医院提供。 1.2 小RNA的提取 用mirVanaTMmiRNA提取分离试剂盒 (Ambion公司) 从白血病细胞株K562细胞中分离小片断RNA(≤200 nt)。按说明书步骤，从1×106个细胞中提取出小片段RNA溶解在30 μl的无RNA酶水中，紫外分光光度计定量。 1.3 miRNA的克隆和逆转录 取1.5 μg RNA和5U多聚（poly）腺苷酸(A)聚合酶置于50 μl反应管中，37℃条件下30 min进行小RNA的多聚腺苷酸化。将带有poly(A)尾的小RNA溶于适量无RNA酶H2O中，在20 μl体积中，应用GeneRacer试剂盒SuperScriptTMⅢRT部分进行反转录：10 μl带有poly(A)尾的小RNA在1 μl反转录引物［5’GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T)243’］、1 μl dNTP混合物(10 mmol/L)和1 μl无菌蒸馏水的孵育作用下，65℃条件下5 min，冰浴1 min，加入5×buffer 4 μl，0.1 mol/L DTT 1 μl，200 U/μl反转录酶1 μl，加水至20 μl，42℃，1 h。最后，反转录酶在70℃条件下孵育15 min灭活。准备cDNA扩增。 1.4 PCR检测目的miRNA 取上述逆转录得到的cDNA进行PCR扩增：①引物：上游引物P1：5’TAGCTTATCAGACTGATGT3’；下游引物