JAK激酶抑制剂AG490联合顺铂对喉癌细胞STAT3信号转导通路的抑制作用论文.docVIP

　　JAK激酶抑制剂AG490联合顺铂对喉癌细胞STAT3信号转导通路的抑制作用论文 王俊阁李晓明路秀英 【摘要】目的:探讨Stat3信号转导通路在药物治疗喉癌中的作用机制.方法：应用JAK激酶抑制剂AG490与顺铂(DDP)处理喉癌细胞系Hep2细胞，TT法检测细胞增殖状态，流式细胞技术检测细胞周期与凋亡.结果:AG490与DDP可以抑制喉癌细胞增殖，促进喉癌细胞凋亡（P=0.008），联合应用AG490与DDP可以起协同作用，喉癌细胞Stat3信号转导通路成员表达与活性明显下降.结论:JAK激酶抑制剂AG490与DDP联合应用可能为治疗喉癌提供了新的理论基础. 【关键词】喉癌增殖凋亡 0引言 细胞因子的信号传导途径之一JAK酪氨酸蛋白激酶(Januskinase,JAK)信号转导子和转录活化子(signaltransducersandactivatorsoftranscription,Stat)途径是近来研究的热点.为了研究Jak/Stat3的活化与喉癌之间的关系，我们应用JAK激酶抑制剂AG490与顺铂（diamminedichloroplatinum.freelL/L小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的RPMI1640培养基(美国Gibcobrl公司)中，于37℃,50mL/LCO2饱和湿度条件下培养，实验所用的细胞均处于指数生长期.JAK激酶抑制剂AG490(美国Calbiochem公司),DDP,RPMI1640液配制药物溶液,根据量效曲线选定药物浓度. 1.2方法研究分组：①对照组；②AG490组；③AG490+DDP组；④DDP组.溶液中含等量乙醇和DMSO. 1.2.1AG490对细胞生长抑制作用的检测接种细胞于96孔板，每孔接种100μL含1×104个细胞,贴壁后,无血清培养细胞16～24h，使细胞同步化.空白对照组加无血清培养基，试验组分别加入AG490至终浓度为30mg/L，DDP的终浓度4mg/L,AG490+DDP组加药顺序为先加AG490，于6h后加DDP，每组设6个重复孔.分别培养至规定时间后，每孔含150μL培养液，0,24,48,.freela公司），继续培养4h，每孔加入5g/L甲臜200μL，弃去培养液，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，酶标仪测定A570nm，重复实验3次,绘制生长曲线. 1.2.2AG490处理后Hep2细胞细胞周期和凋亡率无血清培养细胞16～24h，使同步化，试验组分别加入AG490,至终浓度为30mg/L，DDP的终浓度为4mg/L，继续培养，0,24,48,72h分别消化细胞，0.01mol/LPBS0.5mL重悬细胞，冰乙醇固定细胞过夜,加入RNAaseA至终浓度50mg/L，37℃恒温水浴1h，加入碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）（美国Sigma公司）至质量浓度50mg/L，4℃避光染色1h，流式细胞仪EpicsXLⅡ型（美国BectonCoulter公司）检测,实验重复3次，资料用MulticycleAV细胞周期分析软件处理.同步化处理及单细胞悬液制备同前，应用凋亡检测试剂盒，0.01mol/LPBS离心洗涤2次，200μL结合缓冲液重悬，加入溴乙啶至终浓度1mg/L，加入PI至2.5mg/L，室温避光染色15min，流式细胞仪检测. 1.2.3Stat3蛋白及其靶基因产物表达和磷酸化活化的检测无血清培养细胞16～24h，使细胞同步化.空白对照组加无血清培养基，试验组分别加入AG490至30mg/L，DDP4mg/L；分别用胰酶消化收集对照组、AG490组、AG490+DDP组、DDP组.参照美国Pierce公司蛋白提取方法，分别抽提胞质、胞核蛋白，用考马斯亮蓝G250试剂盒测定蛋白浓度.取总蛋白100μg经100g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转移到PVDF膜上，封闭后，加入Stat3,pStat3,BclxL与CyclinD1小鼠mAb（美国SantaCruz公司，抗体稀释度为1∶70），加入二抗体HRP标记的山羊抗鼠IgG（抗体稀释度为1∶1000），βactin作为内参照，用ELC发光试剂盒（美国Amersham公司）检测杂交信号.用GelPro凝胶分析软件进行半定量分析.用表面密度代表条带的面积乘荧光强度，来表示目的蛋白的相对含量. 统计学方法：数据用x±s表示，采用SPSS11.0统计软件进行分析，组间比较采用方差分析及两两比较法进行. 2结果 2.1Hep2细胞增殖活力Stat3在喉癌细胞系Hep2细胞中持续表达和磷酸化（图1）.对照组没有抑制肿瘤细胞的增殖作用，AG490转染后12h开始表现出一定的增殖抑制效应，36h表现出明显的抑制效应，细胞活力持续下降(F=5.2