JNK通路对亚急性帕金森病MPTP模型小鼠黑质COX2表达的影响论文.docVIP

　　JNK通路对亚急性帕金森病MPTP模型小鼠黑质COX2表达的影响论文 王永生 魏子峰 张作凤 周洪霞 张宇新 【摘要】 目的：研究JNK在1甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶（MPTP）所致小鼠帕金森病（PD）模型中对环氧合酶2(COX2)的表达调控作用，以探讨可能导致PD黑质多巴胺(DA)能神经元变性失活的机制. 方法：采用MPTP制备亚急性PD小鼠模型,观察模型小鼠行为学变化，观察PD模型小鼠黑质区酪氨酸羟化酶（TH）,COX2,磷酸化cJun的表达变化；观察给予JNK通路特异性抑制剂SP600125对上述变化的影响. 结果：与对照组小鼠相比，模型组小鼠出现典型PD症状，在MPTP第3次注射后6 h.freela, USA）,兔抗人COX2 mAb(福州迈新生物),小鼠抗人TH mAb(Chemicon, USA)，兔抗人pcJun mAb（Ser63, Cell Signaling Technology, USA），SP600125(Calbiochem, USA),.freelg/kg,生理盐水溶），1次/d,连续5 d；JNK抑制剂组（Inhibitor）：在第1次MPTP注射前4 h经侧脑室定位注射给予JNK 通路抑制剂SP600125（3 g/L,溶于10 g/L DMSO）一次；对照组（Control）：注射与模型组和抑制剂组等体积的生理盐水和10 g/L DMSO. 于每次注射药物后观察小鼠行为变化, 判断PD鼠模型是否成功. 1.2.2定位注射200 g/L氨基甲酸乙酯腹腔麻醉，动物腹卧位固定，作颅顶正中切口，以25 μL微量注射器作为注射针，进行立体定位，注射坐标为: AP-0.4 mm, ML+1.5 mm, DV-2.2 mm. 注射量5 μL，15 min内匀速注射完后留针10 min, 关闭伤口. 1.2.3标本采集动物分别于MPTP第3次注射后6 h和MPTP最后1次注射后7 d处死. 动物麻醉后，行40 g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液常规灌注固定，迅速开颅取脑，40 g/L多聚甲醛后固定48 h（4℃），石蜡包埋、切片. MPTP第3次注射后6 h所取的标本用于判定JNK通路是否调控COX2 表达；MPTP最后一次注射后7 d所取的标本用于判定PD模型是否复制成功［4］. 1.2.4免疫组化脑组织切片常规脱蜡至水后，用TBST（pH 7.4±0.2）洗3次，每次3 min；组织抗原行水浴法热修复；30 mL/L过氧化氢阻断内源过氧化物酶，TBST洗3次；用正常非免疫动物血清室温孵育10 min；同一组织相邻切片分别加入兔抗人COX2 mAb（1∶100）,小鼠抗人TH mAb（1∶400),兔抗人pcJun抗体（Ser63,1∶100），4℃过夜；TBST洗3次后，加入生物素标记第二抗体室温孵育20 min；TBST洗3次，加入链霉素抗生物素蛋白过氧化酶室温孵育20 min，DAB显色，中性树胶封固，光镜下观察照像. 用DA能神经元特异性标志酶酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）判定模型小鼠黑质区DA能神经元变化；用炎症标志性酶COX2观察黑质区炎症变化；用JNK特异性活性底物磷酸化cJun（Ser63, pcJun）观察JNK信号通路变化. 统计学处理： 选定黑质所在区域，采用CMIAS真彩色医学图像免疫组化自动分析系统进行阳性细胞计数. 各组每只动物的6张脑片数值相加后取平均值，结果以x±s表示，使用SPSS 11.0统计软件行方差分析及LSDt检验，COX2表达组间差异比较用非参数秩和检验. P 0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1PD模型小鼠行为学变化模型鼠于第1次注药后15～20 min均出现不同程度的震颤、竖毛、翘尾，MPTP最后1次注射后，模型鼠出现步态蹒跚、活动减少、动作变慢、前后肢协调性差等症状；对照组未出现上述行为学变化；JNK抑制剂组与模型组比较上述行为学症状明显减轻，7 d后与对照组比较运动功能无统计学差别. 2.2黑质区TH阳性神经元数量变化在MPTP第3次注射后6 h和MPTP最后1次注射后7 d，对照组黑质致密部可见大量TH阳性神经元，且排列整齐，呈条带状. 模型组与对照组相比，可见TH阳性细胞明显减少，差异有统计学意义(P 0.01,图1,表1）.表1各组酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数 2.3PD模型动物黑质区出现COX2高表达在MPTP第3次注射后6 h，模型组可见大量COX2阳性细胞；对照组偶见COX2阳性细胞. 经图像分析，差异有统计学意义（P 0.01,图2，表2）.表2JNK抑制剂对黑质区环氧合酶2(COX2)表达和酪氨酸羟化酶(TH)阳性细