HPV16 E7和Brn3a在宫颈癌前病变中的表达及其意义论文.docVIP

　　HPV16 E7和Brn3a在宫颈癌前病变中的表达及其意义论文 【摘要】 目的 研究HPV16 E7和Brn3a在各级宫颈癌前病变（CIN）中的表达情况以及两者之间的关系，从分子生物学水平探讨其作为宫颈癌前病变的特异性标志物的可能性，以期寻找新的宫颈癌前病变筛查方法。方法 对71例患者行宫颈薄层细胞学检查（Thinprep Cell Test，TCT），并在阴道镜下组织学活检，其TCT残留标本，用RTPCR法检测各标本中HPV16 E7和Brn3a的表达。结果 HPV16 E7和Brn3a表达按细胞学分级和病理学分级其阳性率呈逐级增高趋势，差异均有显著性（P 0.0001）。两者作为宫颈癌前病变和HPV活化状态的诊断标志物.freelRNA表达情况，从分子学水平探讨宫颈癌前病变中高危型人乳头瘤病毒（HRHPV）致癌基因活化情况，以及Brn3a和HPV16 E7作为宫颈上皮内癌变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）的生物标志物的特异性。 1资料和方法 1.1临床资料 选取2004年8月～2004年11月在重庆医科大学附属第一医院行宫颈TCT检查的71位患者，年龄21～63岁，平均36.8岁，所有患者在取样前均未接受任何妇科相关疾病的治疗，用宫颈刷刷取宫颈细胞并洗入TCT保存液中备用。 1.2方法 1.2.1收集细胞标本 用RNase的离心管吸取1ml TCT残留标本底层沉积物，离心后弃上清，沉淀用PBS液洗2次，离心后去上清，-20℃保存备用。 1.2.2RTPCR法（检测HPV16 E7及Brn3a mRNA的表达） TCT残留标本的总RNA提取参照Trizol试剂盒操作程序进行。逆转录采用TaKaRa公司的AMVRT酶，方法按说明书进行。HPV16 E7基因引物设计参照文献2。上游引物：5′ AGCTCAGAGGAGGAGGATGA3′ ，下游引物：5′GGTTTCTGAGAACAGATGGG3′，预计扩增片段长度为203bp；Brn3a基因引物设计参照文献3，上游引物：5′GTCGACATGGACTCGGACACG3′，下游引物：5′AGCCCCCTCAGTAAGTGGCA3′；内对照βactin基因引物设计参照文献4，上游引物：5′ACACCTTCTACAATGAGCTG3′，下游引物：5′CTGCTTGCTGATCCACATCT3′，扩增片段长度为828bp。PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 45s，共30个循环；72℃再延伸，10min。取PCR产物5μl，1.5%琼脂糖凝胶电泳（80V，40mA，60min）。紫光灯下观察摄像。 1.3统计学分析 分析细胞学分级和病理学分级，各组HPV16 E7和Brn3a的mRNA的阳性表达情况，比较两者在宫颈表达中的关系，并进行χ2检验。 2结果 2.1细胞学和病理学诊断结果 见表1。表171例患者的细胞学及病理学诊断 2.2RTPCR检测结果 2.2.1HPV16 E7 mRNA的表达情况 TCT残留标本中，HPV16 E7 mRNA的表达阳性率在细胞学诊断和病理学诊断中，随病变严重程度，呈逐级上升趋势，见图1。在细胞学诊断中，未见癌变细胞者（al limit,,Pisani P,Ferlay J.Estimates of the ajor cancers in 1990［J］.Int J Cancer,1999,80（6）:827841. 2Tao Li,ZheMing Lu,.freelan papillomavirus type 16 is an important infectious factor in the high incidence of esophageal cancer in Anyang area of China［J］.Carcinogenesis,2001,22(6): 929934. 3Ndisang D,Morris PJ,Chapman C,et al.The HPV activating transcription factor Brn3a is over expressed in CIN3 lesions［J］.J Clin Invest,1998,101（8）:16871692. 4Okamoto Y,Yusuke H,Yayoik K,et al.A simple quantitative measurement of mRNA of human βactin by reverse transcription petitive PCR era［J］.Bi