SMART技术构建红曲霉全长cDNA文库论文.docVIP

　　SMART技术构建红曲霉全长cDNA文库论文 .freelechanism at 5′end of RNA transcript)技术构建红曲霉全长cDNA文库， 经涂平板和酶切反应测定文库的克隆数、重组率，PCR测定插入片断的大小。结果 原始文库的库容为2.03×105，重组率达94%。插入片段大小多在0.7～2.0 kb.freeletabolites in Monascus.Methods A cDNA library . The number of the clones and the rebination rate of the library ined by plate coating and restrictive digestion,and the size of inserted fragment ined by PCR. Results The primary library capacity ent size et the requirement for cloning target genes and expressing target proteins. Key in，培养5 d至产生红曲色素。将菌液离心，沉淀分别用蒸馏水、无菌水、DEPC水润洗，干燥，称干重，将样品放于研钵中，加入液氮，研磨至粉状。在样品未融化前加入Trizol reagent，继续研磨使样品溶解。离心，取上清。加氯仿，摇匀，离心，取上清。加异丙醇沉淀RNA。75%(φ)乙醇洗涤沉淀，风干RNA，用无RNase水溶解沉淀，-70 ℃保存。得总RNA。使用紫外分析仪检测总RNA浓度、纯度，1.1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。 1.2.2 双链cDNA的合成 广东药学院学报 第25卷 第3期 朱碧云，等.SMART技术构建红曲霉全长cDNA文库 在5 μL反应体系中加入1.0 μg total RNA、SMART Ⅳ Oligonucleotide (5′AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG3′) 1 μL、CDS Ⅲ/3′PCR引物5′ATTCTAGAGGCCGAG GCGGCCGACATGd(T)30 N-1N3′( N=A、G、C or T;N-1=A、G or C 1 μL，用无RNase水补足到5 μL。混匀，短暂离心，72 ℃，2 min;冰上冷却2 min，短暂离心;向反应液中加入5×第一链反应缓冲液2.0 μL及20 mmol/L DTT、10 mmol/L dNTP混合液、MMLV逆转录酶各1 μL于42 ℃孵育60 min，置于冰浴中终止反应。取2 μL第一链产物于干净预冷0.2 mL反应管中，进行PCR扩增。引物为5′PCR引物(5′AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT3′)、CDSⅢ/3′PCR引物。循环条件为：首先把PCR仪预热到95 ℃，再20个循环：95 ℃ 15 s，68 ℃ 6 min。1.1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并估算其浓度。 1.2.3 cDNA 的分级分离纯化及文库构建 合成的双链cDNA经蛋白酶K消化及SfiⅠ酶切后，柱层析分级，共收集15管，每管取3 μL进行1.1%琼脂糖电泳检测，合并能显示亮带的前4管(片段 0.4 kb)，进行沉淀，重悬在去离子水中，加T4DNA连接酶，与质粒载体pDNRLIB(经SfiⅠ酶处理过)于16 ℃下连接过夜。cDNA与载体的比例为1.5∶1。连接产物经电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。电击条件：电击杯内径0.1 cm，电容25 μF，电阻200 Ω，电压1.8 kV，感受态25 μL,电转仪：BIORAD Gene Pulser Xcell 电穿孔仪。将转化产物转移到加有1 mL LB培养基的试管中，225 r/min，37 ℃，培养1 h。 1.2.4 原始文库质量鉴定 取适量原始文库菌液，均匀地涂在含30 μg/mL氯霉素的LB平板上，随机挑取15个克隆，提取质粒经SfiⅠ酶切后电泳检测，可测定其重组率及重组片段的大小。文库的扩增采用涂平板培养扩增。取适量原始文库均匀地涂在10个含30 μg/mL氯霉素的LB平板，37 ℃倒置培养过夜，用含有25%(φ)甘油LB培养基洗脱所有的菌落，2 mL/板，将每板的洗脱液混合摇匀即得到了扩增文库，检测其滴度，分装，放置-80 ℃保存。 2 结果分析 2.1 总RNA提取 提取的样品总RNA经紫外分光光度计测定，A260/A280值为1.77，表明所得总RNA纯度较高，但稍有降解。1.1%琼脂糖凝胶电泳结果显示(图1)，28 S rRNA、18 S rRNA和5.8 S rRNA三条特征条带清晰，表明总RNA比