高效液相色谱法同步测定饲料中的五种脂溶性维生素.pdfVIP

高效液相色谱法同步测定饲料中的五种脂溶性维生素 贺平丽薛秀萍 (中国农业大学农业部饲料工业中心，北京100094) 摘要建立了用高效液相色谱法同步检测饲料中的维生素K”A—ac、D3、E、E—ac的方法，并进行了 方法确证。饲料样品在0．2％的氨水中用碱性蛋白酶破坏维生素外的包被物质，用乙醇萃取游离出的维生素，用 目相萃取小柱和有机滤膜纯化后，经c18柱分离，以甲醇和水(98：2，v／v)为流动相洗脱，并经uV检测嚣在 230m和265m处栓潢6。 关键词高效液相色谱维生素固相苹取饲料 脂溶性维生素A、D、E、K主要存在于脂溶性溶剂中，分子结构只含有碳、氢、氧三种元素， 在饲料中常与脂质共存，在消化道内也随脂肪一同吸收。当维生素吸收不足时，会引起相应的缺乏症 状；当吸收过量时，又会对机体产生毒害作用。到目前为止，各种各样的检测方法已经报道用于脂溶 性维生素的检测。但这些方法主要是将样品皂化后，直接用液相色谱分析，方法复杂、干扰大、且回 收率低。 本实验拟从色谱条件优化、样品前处理、方法性能等几个方面对维生素b、A一∞、D3、E、E— ac进行研究，建立一种快速、简单、准确的方法同步检测饲料中5种脂溶性维生素，为饲料品质的 监督管理提供科学的方法。 1实验部分 1．1色谱条件 进样量：10—20山。 1．2样品的前处理 O．2％氨水，混匀后在40— 称取饲料样品及碱性蛋白酶酶置于100Illl棕色容量瓶中，加入10IIll 30min，取出，在暗处冷却后用无水乙醇定容，摇匀。转移至50甜离心管中于离心机上以5000rpm 的转速离心10min，取1111l上清液过OasisHLB小柱，净化后上机。 1_3同相萃取法(sPE)净化 (55屯)，向试管中加人65％乙醇1．O“，涡旋震荡，作为待上柱的样品溶液。 将Oa8is 5％甲醇淋洗液淋 的上柱的样品液全部加到小柱上，控制过柱流速不超过1．0mL，min，然后用1．Onll 转移到样品瓶中，盖好，上机待用。 ·531· 籀营养与饲嚣}研究逝展 1．4仪器设备 (粒径5扯m，150×4．6咖i．d．，waters，爱尔兰)；保护柱20x4．6mm，5pm(美国Ⅵ■te碍公司)； 0AsIs HLB小柱(1 实验室技术有限公司)；TDL一5一A离心机(上海安亭科学仪器厂，中国上海)；固相萃取装置(加 拿大A百knt公司)。 2结果与讨论 2．1色谱条件 5种脂溶性维生素在优化的色谱条件下得到很好的分离，其色谱图见图1。 41)00 3000 }舢 ．羞 ‰1000 0 0 4 8 12 16 20 圈1 中脂溶性维生素的色谱分离图 波长：230啪；流速：1．OmL，mi“；流动相：甲醇：水(98：2，v／v) 2．2线性关系 为4．5—213．o斗g／Inl，峰面积与浓度呈显著的线性关系。 2．3准确度 称取109空白样品或已知含量的样品，分别按表2—8中添加不同水平的维生素，按该实验样品 前处理方法，制备供试液。按上述色谱条件测定峰面积，计算回收率及变异值，结果见表1。从结果 可以看出，维生素D，、E、E一”均有较好的回收率且变异较小，而维生素b在低水平添加时，它 的回收率达到约130％，变异系数为8．8％，造成的可能原因是维生素k出峰时间较早，维生素k 受杂质干扰较大。 3结论 本文建立了同步检测饲料中5种脂溶性维生素的高效液相色谱方法，用酶解替代皂化并结合固相 萃取，实现了对饲料样品中脂溶性维生素K。A—ac、D，、E、E一∞的同