枯草芽孢杆菌β1314葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学特性分析.pdfVIP

枯草芽孢杆菌B一1，3—1，4一葡聚糖酶基因 在毕赤酵母中的表达及酶学特性分析 乔家运曹云鹤李一航李德发 (农业部饲料工业中心，中国农业大学，北京100094) 赤酵母x一33感受态细胞。经过抗生素；∞ciJl筛选荻得重组茵椿。摇瓶发酵结果显示。分泌蛋白的分子量太小 约3l 值是6．4。外滩基因在重组毕赤酵母中有很好的遗传稳定性。 美键词枯草芽孢杆菌B—l，3—1．4一葡聚糖醇毕赤酵母表达 B—l，3一l，4一葡聚糖由葡萄糖分子通过B—l，3和B—l，4糖苷键连接而成…，是大麦和燕 麦等一些谷物中的主要抗营养因子，不能被畜禽消化道内源消化酶降解。p一1，3—1，4一葡聚糖的 抗营养作用主要表现在三个方面：一是因为不能被畜禽消化吸收而直接降低了这些谷物的能量价值； 二是在畜禽肠道中呈黏性，包裹消化道食糜，使之不能与消化酶充分接触，而降低营养物质的消化 率；三是食糜黏度增加为有害微生物繁殖提供充足的营养，利于有害菌的定居和增殖。B一1，3—1， 4一葡聚糖酶就是能够专一降解B一1，3一l，4一葡聚糖的酶制刺。国内外一些研究报道从芽孢杆菌 中克隆出B一1，3一l，4一葡聚糖酶基因”“J，并实现了在大肠杆菌”。和酵母菌”。中表达。 本研究将一株枯草芽孢杆菌MAl39的B一1，3一l，4一葡聚糖酶基因构建到毕赤酵母组成型表 达载体中，实现了该基因在毕赤酵母中的高效分泌表达。 l材料与方法 1．1菌种和质粒 pGA‰A购自IIl“trogen。 L2试荆和培养基 z∞cin)。 2％D—glucose、lM山梨醇(8arbi吼)、2％agar，加入loo斗吕／IIll 。 1．3感受态细胞的钼备 大肠杆菌Toplo感受态细胞按照分子克隆”1的方法制备。 毕赤酵母感受态细胞制备方法：接种酵母菌入YPD培养基中，摇菌过夜，转接人一瓶新的YPD 次，5000rPm，6nlin，用预冷的1M山梨醇洗1次，溶于适当体积的1M山梨酵中。 1．4毕赤酵母表达载体构建与转化 根据GenB“k里公开的枯草芽孢杆菌B—l，3—1，4一葡聚糖酶基因的序列，比对后设计一对引 ·431· 箍营养与饲料研究进展 mix 25一，Bs—glull山，Bs— 以基因组DNA为模板进行PcR，反应体系(50山)：DNAl一，PcR glu2l一，ddH20 200 Pemer热循环仪上进行．PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。挑取阳性克隆测序出B一1，3— 1．4一葡聚糖酶基因原始序列如图1所示。 l TS AAS A TG G S l GLF MS LCA I O 6l FN S GFW KANG YS 2l FFEP S YN O 12l 41 NG D MFNCTWRANNVS VTS S G 18l 6l EMRLALT S PS YNKF DCC ENR 24l S A TYGYG LYEV RMKPAKNT 81 O 30l F YTGPTDGTPWDE 10l G I V S S F T