可以用检查雄性动物接触化学毒物后精子畸形率的高低.pptVIP

Dept. of Toxicology School of Public Health Xinjiang Medical University 实验五 小鼠精子畸形试验 实验目的 学习小鼠精子畸形试验原理 掌握精子畸形试验的制片方法 学习掌握观察畸形精子形态 掌握试验的结果分析评价 4 1 2 3 实验原理 精子畸形是指精子的形状异常和异常精子数量的增多。，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。 实验原理 生殖系统对化学毒物的作用十分敏感，在其它系统还未出现毒性反应之前，生殖系统可能已出现了损害作用。正常情况下，哺乳动物的精液中也存在少量的畸形精子，但在某些化学毒物的作用下，特别是在可引起生殖细胞遗传性损伤的化学毒物作用下，哺乳动物睾丸产生的畸形精子数量可大量增加。因此，可以用检查雄性动物接触化学毒物后精子畸形率的高低，来反映该化学毒物的生殖毒性相对生殖细胞潜在的致突变性。 器材与试剂 器材 眼科手术剪、眼科镊子、玻璃平皿、显微镜、擦镜纸、带橡皮头吸管。 器材与试剂 试剂 磷酸盐缓冲液(称取NaCl 8g、KCl0.2克、KH2PO40.12g、Na2HPO40.91g，用蒸馏水溶解并定容至lL)、生理盐水、甲醇(分析纯)、甲基磺酸甲酯或甲基磺酸乙酯或环磷酰胺、2%伊红水溶液。 动物选择 剂量与分组 染毒与采样 制片 阅片 操作步骤 操作步骤 操作步骤 1.动物选择 成熟的大鼠、小鼠均可使用。一般采用雄性小鼠，年龄宜在6-8周。因小鼠较为经济，且有大量实验证实小鼠在该试验系统中对化学毒物较为敏感。 操作步骤 2. 剂量与分组 试验至少应设3个以上剂量组，并同时设立阳性对照组和阴性对照组。接触化学毒物后每组至少应存活5只动物。最高剂量组5天总剂量应能使部分动物死亡。 一般可采用LD50的2—4倍剂量，或预先做5天给予化学毒物的LD50。，以求得最高总剂量，然后以它的l/2(或1/5、1/10)作为下一剂量组的接触剂量，依此类推。 操作步骤 阳性对照可用环磷酰胺20mg/kg或甲基磺酸甲酯75mg/kg或甲基磺酸乙酯60mg/kg进行腹腔注射，每天一次，连续5天。阴性对照选用与受试化学毒物相同体积的溶剂。 对于不稳定或稳定性不详的受试化学毒物，应每天新鲜配制。 操作步骤 3. 染毒与采样 可采用一次或每天一次连续5天的方法进行染毒。染毒途径多用腹腔注射，也可采用与人体实际接触化学毒物相同的途径，如经口、吸入和皮肤接触等。 一般认为精原细胞后期或初级精母细胞早期对化学诱变剂较为敏感、在接触化学毒物后4-5周精子畸形率最高，故选择在第一次染毒后第35天进行采样。也可在染毒后第1、第4和第10周分三次采样，或者在染毒后每周采样一次，连续进行动态观察，直至精子形态恢复正常。 操作步骤 4. 制片 用颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹腔，分离并摘取双侧附睾，将附睾放入盛有约3ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的小平皿中。以眼科剪将附睾尾剪成小块，用吸管将悬浮液轻轻吹打5～6次，静置3～5min，用四层擦镜纸滤除组织碎片，吸取此精子悬液滴于清洁载玻片上，均匀推片，待被片晾干后用甲醇固定5min，干燥后即可镜检观察精子形态。也可用2%的伊红水溶液染色1～2h后再作镜检。 操作步骤 5.阅片 在高倍镜下检查精子形态，可加上蓝色或绿色滤光片。每只小鼠检查完整的精子200-500条，每个剂量组至少检查1000条精子。 阅片 正常精子的形态 正常精子似蝌蚪状，由头、体、尾三部分构成。 (1)、头部略扁，呈卵圆形，轮廓规则，顶体清楚，顶体帽覆盖头部表面的l/3以上，在精子头部前端呈透亮区。头长3～5μm，宽2～3μm，长宽比为1.5～2:1，长宽比值是判断精子形态是否正常的重要数据之一。 (2)、体中段细长，不到头宽的 l/3，轮廓直而规则，与头纵轴成一直线，长约5～7μm，宽 lμm。 (3)、尾部细长，外观规则而不卷曲，一般长50～60μm。 阅片 图1 正常精子镜下图（左：瑞氏染色，右：未染色） HE染色，顶体呈淡红色，核位于顶体基部，呈紫红色，尾部呈淡紫红色。改良巴氏染色，顶体呈淡绿色，核呈紫红色，尾部呈绿色。 阅片 精子畸形主要表现： 在精子的头部，可分为：无钩、香蕉形、无定形、双头、胖头、尾折叠及双尾等形态。 图2 畸形精子模式图 阅片 图3 精子头部畸形 （左：长头与不定型头精子，右：巨头精子，