几种双向凝胶电泳蛋白质检测方法的比较论文.docVIP

　　几种双向凝胶电泳蛋白质检测方法的比较论文 .freel of this study al staining method for proteomic research. Proteins from acute promyelocytic leukemia cell line NB4 and protein molecular arker assie brilliant blue，the colloidal Coomassie brilliant blue，the modified Coomassie brilliant blue and the silver staining protocols. The protein detection sensitivity，patibility ass spectrometry (MS) and facility of the four staining protocols odified Coomassie brilliant blue staining assie brilliant blue stainings，close to but loodified Coomassie brilliant blue staining is high，and its patibility odified Coomassie brilliant blue staining is an optimal staining method for proteomic research. Key ics；tensional gel electrophoresis；protein detection；Coomassie brilliant blue staining；silver staining 蛋白质组研究要求有高分辨率的蛋白质分离及准确、灵敏的质谱鉴定技术。凝胶电泳中蛋白质的着色不仅影响蛋白质分离的分辨率，同时也影响后续的质谱鉴定。选择适当的蛋白质染色法将有助于提高蛋白质组学研究结果的质量。蛋白质的染色常用的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法（Coomasie brilliant blue，CBB）为代表，在蛋白质分析中常用，但对低丰度蛋白质的显现较差；银染灵敏度虽高，却常与质谱不兼容；荧光染色以SYPRO试剂为主，蛋白质检测灵敏度高，能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵，未被作为常规方法使用；而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题［1-4］。因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组研究所需。由于考马斯亮蓝染色法的广泛运用，近年来就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们作了许多改进，方法众多，评价不一 ［5-7］。我们在作双向凝胶电泳时，将常用的几种考马斯亮蓝染色 法及银染进行了比较，并就其染色影响因素作出分析。 材料和方法 试剂 固相pH梯度干胶条（IPG strip pH3-10NL，IPG strip pH5-8，17cm）、urea、CHAPS、TBP、DTT、Bio-Lyte 3/10 Ampholyte、IAM、SDS、Tris、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、CBB-G250均为BIO-RAD公司产品。硫酸铵及磷酸均购自成都科龙试剂厂。AgNO3为Sigma公司出品。Protein molecular arker #SBI公司出品。甲醛、Na2S2O3 与Na2CO3分别为成都天华科技股份有限公司、重庆北碚化学试剂厂和天津市塘沽鹏达化工厂产品。 仪器 IPGphor等电聚焦仪、proTEANⅡ垂直电泳仪、Poeter扫描仪、PDQuest凝胶图像分析软件均为BIO-RAD公司产品。 细胞总蛋白质的提取 取4份经常规培养的急性早幼粒白血病细胞株（NB4）1×107细胞各重悬于350 μl蛋白质裂解缓冲液中（8 mol/L Urea，2 g/L CHAPS，2 mmol/L TBP，2 ml/L Carrier Ampholyte，痕量溴酚兰），置冰浴中超声裂解，静置30分钟，15 500×g离心30分钟，取上清，进行蛋白质定量。 单向定量电泳 取蛋白质分子量标准物，第一次按1∶2稀释后，以后按1∶3倍比例逐级稀释，经4级稀释后，取15 μl上样液上样，β-半乳糖苷酶上样量依次分别为1 μg、0.24 μg、0.062 μg、0.0156 μg、0.004 μg。作12 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶单向电泳，同时电泳4份胶，显色以确定染色灵敏度。 双向电泳 取300 μl样品液沿水化盘中槽的边缘自左向右线性加入，将17 cm IPG胶条胶面朝下置于槽中，