ＡＦＬＰ分子标记及其在植物遗传学研究中的应用.docVIP

ＡＦＬＰ分子标记及其在植物遗传学研究中的应用 　　本文简述了AFLP(Amplified Fragment Length Polymoplvism) 分子标记技术的原理和技术流程，并对其在植物遗传作图与基因定位、种质资源鉴定、植物分类、进化及遗传多样性等方面的应用作了概述。 　　遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。遗传标记可以帮助人们更好地研究生物的遗传与变异规律。在遗传学研究中遗传标记主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转移等。 　　随着分子遗传学技术的发展和PCR技术的出现，人们将目光投向直接基于DNA和PCR技术的分子标记技术，如基于DNA分子杂交的RFLP和基于PCR反应的RAPD、AFLP、SSR等分子标记技术已广泛应用于植物基因组研究[1，2]。 　　AFLP(Amplified Fragment Length Polymoplvism)分析技术是由Zabeau等于1992年发明并由Vos等发展起来的一种检测DNA多态性的新方法[3，4]。由于结合了RFLP和RAPD的技术优势，AFLP兼具了稳定性强和灵敏度高的特点，同时也因为它丰富的多态信息量（polymorphism information contents, PIC）和易操作性而被广泛用于DNA指纹分析、遗传图谱构建、基因鉴定和克隆、基因表达、遗传多样性等方面，是近几年发展最快的DNA分子标记技术。下面对AFLP技术的原理、操作及其在植物遗传、进化等领域的应用进行简要介绍。 　　 　　1AFLP标记的基本原理 　　 　　AFLP的基本原理(见图1所示)是基因组DNA经限制性内切酶完全消化后，在限制性片段两端连接上人工接头作为扩增的模板。实际的引物与接头和酶切位点互补，并在3加上2～3个选择性碱基，因此在基因组被酶切后的无数片段中，只有一小部分限制性片段被扩增，即只有那些与引物3端互补的片段才能进行扩增，称为选择性扩增。为了对扩增片段的大小进行灵活的调节，一般采用两个限制性内切酶。一个是切点多的酶，如具有4碱基识别位点的MseI，它产生较小的DNA片段，另一个是切点少的酶，如具有6碱基识别位点的EcoRI，它产生较大的DNA片段。上述两种酶产生三种酶切片段，理论上90%以上为MseI-MseI片段，只有一小部分为EcoRI-EcoRI片段，EcoRI-Msel片段为EcoRI酶切位点的两倍左右，扩增的片段主要是两个酶的组合产生的酶切片段。Vos等[3]指出，多切点的酶产生小的DNA片段，这些片段能很好地扩增，适于在变性序列胶上分离，少切点的酸可以减少被扩增的片段，只有两种酶组合后产生的片段即E-M才是主要扩增的片段，故采用双酶切可以极其灵活控制被扩增片段的大小和数目。再者在合成引物时只需用同位素或荧光标记EcoRI引物或MseI引物，故采用双酶切有可能对双链PCR产物进行单链标记，从而避免了由于双链扩增片段在变性电泳胶上不均等迁移而造成的误差，并通过少数引物的多种组合可产生极其大量的DNA指纹。 　　 　　2 AFLP的技术流程 　　 　　AFLP技术流程主要包括三个步骤：①经限制性内切酶酶解后的DNA限制性片段，与双链多聚核苷酸接头（adapter）连接；②利用PCR方法，通过变性、退火、延伸循环，选择性扩增成套的限制性片段，经过多次循环，可使目的序列扩增到0.5～1ug；③延用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测扩增的DNA片段。 　　2.1 DNA限制性片段的获得及其与接头的连接 　　基因组DNA通过限制性内切酶酶解产生限制性片段。一般使用两种限制性内切酶。酶切完成后在T4连接酶作用下与接头进行连接反应。 　　 　　Fig1 the principle of Amplified Fragment Length Polymorphism 　　2.2限制性片段的选择性扩增 　　AFLP反应一般使用两种引物，扩增条件根据AFLP引物的选择性碱基性质而定。对于较复杂基因组的AFLP分析一般两步扩增策略，即先用无或单选择碱基引物进行预扩增。一般来讲，预扩增引物选择碱基数为1个，选择性扩增引物的选择碱基数为3个。预扩增能够为正式扩增提供足够的模板，而且其中的两个引物无需同位素标记。预扩增产物用TE（pH8.0）缓冲液稀释10倍后用于第二步的选择性扩增反应。其中引物的选择性碱基为2-3个，可根据基因组大小和实际扩增情况来确定引物末端所需的选择性核苷酸数目。经验指出，一般大于108bp的基因组DNA可用两个末端各有3个选择性碱基的引物进行扩增，而105-108bp基因组DNA可用两个分别含有2个或3个选择性碱基的引物进行扩