开题报告丁小红毕业设计(论文)开题报告.doc

杭 州 师 范 大 学 本科生毕业设计（论文）开题报告 题 目 Isl1lacZ/Isl2GFP两种用于分析Isl1/Isl2基因表达模型的标签小鼠的基因型鉴定142 学生姓名 丁小红 学 号 2014214138 指导教师 盛东来 职 称 讲师 一、选题背景与意义（说明所选课题的历史背景、国内外研究现状和发展趋势） 小鼠作为哺乳动物遗传研究中首选的模式生物。经过过去几十年的努力，培育基因打靶和转基因小鼠已经变成很平常的工作，以目前的技术可以获得在核酸水平上的突变品系。现在，诸如此种基因组修饰变得越来越精细，而在基因水平上标记不同的细胞群已成为非常普遍的研究。 Lac Z，即细菌β-半乳糖苷酶基因在许多小鼠研究中作为筛选标记，它是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．Beta-gal比较稳定，用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色，便于检测和观察．LacZ基因的诸多优点使它成为基因工程实验中的一-半乳糖苷酶显色反应选择法，即，蓝白筛选．例如，基因克隆中常用的质粒载体PUC 19及噬菌体载体M13系列均带有LacZ基因。 GFP,即绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein )其自身的特点，它能够在体内或体外进行实时监测。GFP还有另一个优势，能采用流式细胞仪、共聚焦显微镜及荧光计等技术进行定量检测。目前，人们已经改进了野生型GFP基因，从中获得的几种变体在热稳定性和荧光强度等方面都有所增强。增强型GFP（EGFP）就GFP光谱变体，其中两种全新颜色的变体——增强型黄色荧光蛋白（EYFP）和增强型蓝绿色荧光蛋白（enhanced cyan fluorescent protein, ECFP）已应用于小鼠研究中。 由于ECFP和EYFP的谱线轮廓截然不同且没有重叠，所以这两种荧光蛋白可同时用作报告基因并共同显色，这对体内双标记或荧光能量转移分析等研究是非常理想的。GFP及其颜色变体作为报告蛋白的应用为科学研究提供了一 因此本文将通过Isl1lacZ/Isl2GFP两种用于分析Isl1/Isl2基因表达模型的标签小鼠的基因型鉴定。 研究基本内容： 小鼠解剖、DNA采集与提取、引物设计、基因片段PCR，琼脂糖凝胶电泳 拟解决的主要问题： 作为导师研究课题的一部分，完成基因型鉴定后为后续实验奠定基础。 三、研究方法及措施（拟采取的研究手段及技术路线、实验方案等） 1、小鼠解剖： （1）准备实验工具（PBS缓冲液、培养皿、解剖工具等）； （2）捏住母鼠尾巴中部将母鼠提起，置于鼠笼上，用颈椎脱臼法处死； （3）用75%酒精喷壶喷湿母鼠腹部皮毛，在培养皿中倒入PBS缓冲液； （4）用镊子提起母鼠腹部皮肤，用剪刀横向剪一个创口，撕开； （5）用剪刀剪开腹腔膜，用镊子取出子宫，移至培养皿中； （6）在体视显微镜下操作，用镊子撕开子宫及羊膜，分离胚胎； （7）将胚胎移至干净PBS缓冲液中，剪尾做DNA提取； 2、DNA采集与提取： DNA采集 （1）剪取小鼠尾巴约0.3里面置EP管备用； （2）解剖小鼠取视网膜、内耳、血液、心肌、皮肤等组织部分置EP管备用。 DNA提取 方法一：碱裂解法 （1）剪取0.3厘米小鼠尾于1.5ml EP管 （2）加入100ul 50M NaOH （10ml stock of 50mM NaOH=9.95ml ddH20+50ul 10N NaOH） （3）95℃加热10分钟，涡旋 （4）加入10ul 1M Tris（PH=8.0），涡旋 （5）12000g离心5分钟 （6）加入100ul TE（PH=8.0） 方法二：蛋白酶消化 （1）剪取0.3厘米小鼠尾于1.5ml EP管 （2）加入400ul Tail digestion buffer及2-5ul 10mg/ml proteinase K （3）60℃加热，过夜 （4）加入200μl酚氯仿异丙醇溶液，涡旋至乳白色，14000g离心5分钟 （5）吸取300ul上清液至新EP管，加入900ul 100%乙醇，摇动4-6次， 14000g离心1分钟 （6）倒去上清液，加入350ul 75%乙醇，14000g离心1分钟 （7）倒去上清液，自然风干 （8）加入50ul TE（PH