结核杆菌DnaA蛋白在耻垢分枝杆菌中的同源表达.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（８）：７２７５ 结核杆菌ＤｎａＡ蛋白在耻垢分枝杆菌中的同源表达 周爱萍　陈艳炯　李　薇　张旭燕　徐纪茹 （西安交通大学医学院免疫学与病原生物学系　西安　７１００６１） 摘要　目的：在耻垢分枝杆菌中表达重组结核杆菌ＤｎａＡ蛋白并对表达产物进行鉴定。方法：用 ＰＣＲ的方法扩增结核杆菌ｄｎａＡ基因并克隆至表达载体ｐＭＦ４０６中，构建重组大肠杆菌分枝杆菌 穿梭质粒ｐＭＦｄｎａＡ。经双酶切及测序鉴定后，用电转化的方法将重组质粒转至耻垢分枝杆菌 ２ ｍｃ１５５中。用０．０２％乙酰胺诱导重组耻垢分枝杆菌，对表达产物进行 ＳＤＳＰＡＧＥ和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测和鉴定。结果：重组耻垢分枝杆菌构建成功，ＳＤＳＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ结果显示 该重组耻垢杆菌可以实现结核杆菌ＤｎａＡ蛋白的同源高效表达。结论：结核杆菌ＤｎａＡ蛋白的同 源表达为结核杆菌ＤＮＡ复制机制的研究奠定了基础。 关键词　结核分枝杆菌　耻垢分枝杆菌　ＤｎａＡ蛋白　同源表达 中图分类号　Ｑ７８６ ［３］ ［４］ 　　不同细菌在细胞生命周期方面的不同特性可能与 生长，使细胞的存活能力降低 。Ｇｒｅｅｎｄｙｋｅ等 研究 其染色体复制过程的调节机制有关。细菌染色体ＤＮＡ 发现ｄｎａＡ基因是分枝杆菌 ＤＮＡ复制所必需的基因， 在复制起始以后，ＤＮＡ链合成的速度相同，结核杆菌生 ［５］ 此外Ｋｕｍａｒ等 对结核杆菌的休眠机制进行研究时发 长缓慢，每１８～２２ｈ才进行一次染色体复制，而大肠杆 现，ＤｎａＡ蛋白参与结核杆菌的休眠，当细胞内游离的 菌在３７℃时每２０ｍｉｎ就进行一次染色体复制，这种差 ＤｎａＡ蛋白与ｏｒｉＣ的结合被 ｌｃｉＡｌｉｋｅＰｒｏｔｅｉｎ抑制后会 异很可能与结核杆菌ＤＮＡ复制起始的严格控制有关。 导致结核分枝杆菌进入休眠状态。 由于生长缓慢，培养困难，结核杆菌遗传学的深入研究 　　制备大量的有生理功能和天然状态的结核杆菌 受到了极大阻碍，因此目前对结核杆菌ＤＮＡ复制起始 ＤｎａＡ蛋白，是进一步研究 ＤｎａＡ蛋白在结核杆菌染色 调控的机制尚未完全搞清楚。 体ＤＮＡ复制过程中的精细调节机制的关键。为此，本 　　ＤｎａＡ蛋白是广泛存在于原核生物中的一种保守 研究使用转化效率比较高的ｐＭＦ４０６质粒作为载体，以 蛋白，它参与细菌染色体 ＤＮＡ的复制起始，并在整个 耻垢分支杆菌为表达宿主菌，构建了表达结核杆菌 染色体复制过程中发挥精细调节的作用，是原核生物 ＤｎａＡ蛋白的重组耻垢分枝杆菌，并成功地进行了同源 ［１］ 表达，为进一步对ＤｎａＡ蛋白功能的研究奠定了基础。 生命活动中所必需的成分 。在大肠杆菌中，ＤｎａＡ与 染色体中唯一的复制原点ｏｒｉＣ结合，染色体开始沿两 １　材料与方法 个方向复制，直至结束，整个复制过程受到严格调控。 ＤｎａＡ与ｏｒｉＣ的结合是 ＤＮＡ复制起始活动所必需的， １．１　材　料 且该复制起始过程有赖于细胞内游离的 ＤｎａＡ的数 　　结核分枝杆菌标准菌株Ｈ３７ＲＶ基因组ＤＮＡ由复 ［２］ 旦大学生命科学学院提供，耻垢分枝杆菌标准菌株 量 。增加一个或多个 ＤｎａＡ表达时，会导致 ＤＮＡ复 制起始的增加，复制叉移动速率减慢甚至停滞，染色体 ｍｃ２１５５由ＪｏｈｎｓＨｏｐｋｉｎｓ大学医学院结核病研究中心 出现丝化现象，细胞变长，诱发的ＳＯＳ反应会抑制细胞