琼脂糖电泳步骤.doc

带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法 泳动率是带电颗粒在一定的电场强度下，单位时间内在介质中的迁移距离。泳动率与样品分子所带的电荷密度、电场中的电压及电流成正比，与样品的分子大小、介质黏度及电阻成反比。不同大小的带电分子具有不同的泳动率，在不同的介质条件下又具有不同的分辨效率 影响泳动率的因素包括样品的物理性状、支持物介质、电场强度和缓冲液离子强度 DNA的凝胶电泳常使用两种支持介质：琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应 在碱性缓冲液中DNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型 琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子 可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子，常采用TAE、TBE和TPE三种缓冲体系 EB：即溴化乙锭，它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测10ng 的DNA 注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套 琼脂糖核酸电泳1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子； 2.根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液；1.0%即每100ml 0.5X TBE中加入1g琼脂糖） 3.放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固； 4.室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内； 5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去； 6.在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内； 7.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般电压，电泳即可； 8.?根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳； 9.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围 琼脂糖凝胶浓度 线形DNA的最佳分辨范围（bp） 0.5% 1,000～30,000 0.7% 800～12,000 1.0% 500～10,000 1.2% 400～7,000 1.5% 200～3,000 2.0% 50～2,000