第四讲 组培中常见的问题与对策.ppt

玻璃化苗的特点 在形态解剖与生理上，玻璃化苗有如下特点： ①玻璃化苗植株矮小肿胀、失绿、叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎 ②叶表面缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，仅有海绵组织而无栅栏组织 ③体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低 ④吸收营养与光合功能不全，分化能力大大降低，苗生长缓慢、繁殖系数大为降低，甚至死亡 ⑤生根困难，移栽成活率低 玻璃化发生的影响因素 1）材料 培养材料种类和外植体类型及大小显著影响着玻璃苗的发生。 外植体越幼小，发生玻璃化苗的几率越大； 同种植物不同外植体部位差异很大，如青菜花花蕾所诱导芽74%正常，子叶、上胚轴、花序柄诱导芽全部为玻璃化苗。 2）培养的环境条件 光照、温度、湿度、pH均影响着玻璃化的发生 组培所需温度一般为24~28度，温度过高，生长过快易玻璃化，特别是长时间高温，玻璃化现象会更严重； 继代次数越多，发生玻璃化概率越大。 3）培养基成分 培养基中NH4+和Cl-过多容易导致玻璃苗的发生，提高Zn2+或Mn2+均可降低玻璃化发生。 MS培养基是控制玻璃化发生比较理想的培养基。 4）琼脂的浓度 有研究表明，液体培养比固体培养形成玻璃化苗的概率要大； 琼脂浓度与玻璃化苗发生率呈极显著的负相关关系，说明提高琼脂浓度是控制玻璃化苗的有效途径，但是琼脂浓度过大，会降低试管苗的繁殖系数，而且生长缓慢。 5）糖源和植物激素 糖作为碳源，除了为细胞提供合成新化合物的碳骨架的能源外，还可以维持一定的渗透压，在MS培养基中，糖浓度与玻璃化发生率呈极显著的负相关。 玻璃化苗发生率与细胞分裂素成正相关，其中BA的影响大于ZT（玉米素）。 克服玻璃化现象的对策 1）利用固体培养，增加琼脂浓度，降低培养基水势，造成细胞吸水阻遏。 一般琼脂浓度不低于0.8%，条状琼脂事先用蒸馏水浸泡24小时，粉末状琼脂尽可能选用灰分低于2.5%的产品； 使用Phytagel, Phytagel从假单胞菌分泌而来的一种琼脂的替代物，是葡萄糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖的混合物，具有无色、透亮和高韧性的特点，是配制植物组织培养基和微生物培养基的主要成分。由于其克服了传统琼脂在植物组织培养中的固有缺陷为植物学研究带来了一场新的革命，已经成为了国际公认的植物组培首选产品。 2) 碳源种类和浓度 适当提高蔗糖浓度或加入渗透调节剂（山梨醇），降低渗透势，减少培养基中可获取水分含量，造成水分胁迫。 3）通风调节相对湿度 改善通气状况，降低湿度和供氧状况 选用通气较好的封口膜或棉塞，或组培专用的培养瓶。 4）调节激素浓度 适当增加IAA，GA3，ABA，减少BA； IAA对植物幼茎、叶柄等组织木质化部的分化有直接作用，GA3对蛋白酶、核酸生物合成有促进作用，GA3，IAA的急剧下降可能诱发这些物质合成的失调； 而适当的ABA含量是维持植物正常生长所必需的。 用ZT替代BA等； 5）控制温度，增加自然光照 适当低温处理，避免过高的培养温度，培养室温度不宜超过32度； 另外，实验发现，玻璃苗放自然光下几天后，茎叶变红，玻璃化现象逐渐消失。自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化进程。 本节完 本节问题： 植物组织培养中经常遇到的问题有哪些，如何应对？ * 植物组织培养中常见的问题与对策 在组织培养中，特别是许多初期从事植物组织培养的工作者，因为不能掌握组织培养工作中的一些技术环节，常导致工作失败或延误工作进程，造成巨大经济损失。 最常见的问题主要有：污染、褐变和玻璃化。 一、污染的原因及对策 污染（Contamination）是组织培养过程中外来微生物迅速繁殖滋长，从而导致培养物感染的现象，是组培过程中经常遇到的问题之一。 控制污染是组织培养中的首要技术。 影响污染的因素 外植体的种类，取材的季节、时间，预处理方法； 消毒剂的种类、浓度、处理时间； 培养基和器皿消毒灭菌； 操作与工作环境； 超净台； 1 真菌性污染及对策 真菌种类繁多，在自然界分部十分广泛，绝大多数真菌对营养要求较低，在适宜的条件下室温就可以生长繁殖。 如果长时间不处理真菌污染的材料，真菌易形成孢子扩散到空气中； 对策：及时处理真菌污染材料，灭菌以后再洗刷器皿；经常对操作台进行消毒；培养环境定期熏蒸消毒等。 2 细菌性污染及对策 细菌性污染主要症状是培养材料附近出现黏液状和发酵泡沫状物体，或在培养基中出现浑浊和云雾状痕迹，一般在接种1~2天就可发现。 细菌性污染可分为外源细菌污染和内源细菌污染 外源细菌污染 一般是指外植体带菌、培养基灭菌不彻底、操作不慎而造成的污染。 因此避免外源性污染要从以下几方面注意： 在操作过程中严格无菌操作程序 培养基灭菌保证压力和时间 外植体的选择与彻底消毒，如果是室外取材，应尽量选取晴