PCR及分子标记—培训课件.ppt

生命经纬 其他 ①考古学 ②植物分类学 ③群体生态学 Molecular marker 生命经纬 Introduction 形态标记、细胞学标记、生化标记 数十种技术问世。 万变不离其宗：分子杂交、PCR扩增 第一类：电泳、分子杂交为核心 代表：RFLP、DNA指纹 第二类：电泳、PCR为核心 代表：RAPD、SSR、AFLP 第三类：DNA序列为核心 代表：ITS测序分析 生命经纬 优点 数量丰富、信息量大； 与生长发育无关，取材不受限制； 较多共显性，信息量完整 在真核生物中，基因组DNA多态性要远远多于各种基因的遗传多态性，因为基因组中存在着大量的不编码的DNA序列，它们的变异不受或较少地受自然选择的制约 生命经纬 Applications 种质资源研究 品质纯度鉴定（包括DNA指纹鉴定） 构建遗传连锁图 基因定位（QTL） 标记辅助选择 比较基因组研究 基因克隆（图位克隆） 生物起源、进化、医学及法医学 生命经纬 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) by Botstein(1980) 基本原理：物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱。 优点:共显性，非常稳定 缺点：检测步骤多，周期长，费时、费钱； 用作探针的DNA克隆制备、保存不方便； 放射性同位素 自从人的RFLP图谱构建后，又分别构建了果蝇、牛、大豆、小麦、水稻等多种生物的RFLP图谱。 生命经纬 RAPD(Random Amplified Polymorphism DNA) 1990: Williams(Du Pont)：RAPD; Welsh(Cal.Biology Inst.)：AP-PCR(Arbitrary Primer-PCR) =Random Primer-PCR =Oligo Primer-PCR =SODA(Small Oligo DNA Analysis） Rapid and simple Random primer:9-10bp 生命经纬 与常规PCR的不同 A.引物长度短 常规PCR中需要两个引物，长度20-30个核苷酸。RAPD只需一个引物，长度9-10个核苷酸，而且是随机引物。 B.退火温度低 RAPD引物短，因此退火温度要低，一般为35-37℃。 生命经纬 通用性 --实验步骤少，省工、省力、进度快 --不需先知道基因组的任何分子信息 --所用材料不需有性世代，可用任何单一亲本、任何部位的材料，在没有有性世代的线粒体、叶绿体DNA研究中也可使用； --引物没有严格的种属界限，同一套引物可用于任何一种植物的研究，具有广泛性和通用性。 生命经纬 植物分子生物学中的应用 用于种属特异性鉴定 外源导入基因的追踪 遗传作图 RAPD标记从理论上讲是无限的，而且在端粒及重复顺序上可以找出RAPD标记位点，因此可以做出很密集、很详细的遗传图来。 鉴定染色体上特异的DNA片段，进行基因定位和分离 RAPD易发现多态性，敏感性高。可找出与靶基因连锁的RAPD标记，进行基因定位。 生命经纬 AFLP(Amplified Restriction fragment polymorphism) 瑞士Zabeau等1992年发明 结合了RFLP和PCR技术的特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术高效性。 基本原理：对基因组DNA进行酶切，连上双链人工接头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行选择性扩增。 它将RAPD随机性和专一性扩增巧妙结合，再选用内切酶以达选择的目的。 生命经纬 三个步骤 (1)DNA酶切及人工接头连接，对提取DNA质量要求较高，需避免其它DNA污染和抑制物质的存在； (2) 扩增反应； (3) 通常在4％-6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离 生命经纬 特点 --理论上，可以采用的限制性内切酶及选择碱基的种类、数目很多，所以标记数目是无限的。 --每次谱带在50-100条之间，多态性检测非常有用 --呈典型的孟德尔方式遗传 --可用于作为遗传图谱和物理图谱的位标。 --可用于分析基因组DNA、克隆的DNA大片段， —对模板浓度不敏感，即使模板浓度存在差异，也会得到强度一致的谱带。 生命经纬 缺点 专利技术，试剂盒价格贵 需要同位素或非同位素标记引物，须具特殊防护措施、配套仪器设备 基因组的不完全酶切会影响实验结果，所以实验对DNA纯度和内切酶的质量要求较高。 生命经纬 SSR（ Simple s