食品理化检验食品中转基因成分的检验摘要.ppt

⑤ Mg2+浓度 Mg2+是Taq DNA聚合酶活性所必需的，直接影响着酶的活性和可靠性 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少 DNA模板、引物和dNTP可与Mg2+结合，降低Mg2+实际浓度 假阳性、假阴性 引起假阳性现象的原因 极微量的目标DNA污染都有可能出现扩增条带。 引物设计不合适也会出现假阳性现象 PCR检测常见问题 引起假阴性现象的原因 模板中含有杂蛋白质，Taq酶抑制剂，酚、氯仿、乙醇等有机溶剂 DNA量不足 Taq酶失活、酶活降低或量不足 引物设计不合理 变性温度低，时间短 退火温度不适合等等 PCR检测常见问题 非特异性扩增：引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体 涂抹带、片状带、地毯样带（Smear现象）。 原因：酶过多或酶质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低等。 PCR检测常见问题 DNA的提取纯化 设置阳性对照、阴性对照 确定待测目标序列 引物设计 PCR反应体系的构建 PCR扩增 电泳及结果分析 转基因成分的PCR检测一般程序 原理 通过PCR扩增和凝胶电泳分离可得到大小为170bp的DNA片段，包括花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子和玉米基因组的DNA序列。 PCR定性检测抗虫转基因玉米MON810品系 设计引物 正向引物：玉米基因，5ˊ-TCG AAG GAC GAA GGA CTC TAA CG- 3ˊ 反向引物：CaMV35S启动子（GeneBank编号：V000141，J02048）， 5ˊ-TCC ATC TTT GGG ACC ACT GTC G- 3ˊ 注释：GeneBank是美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库，汇集并注释了所有公开的核酸序列。 PCR反应体系的构建 试剂 终浓度 加样体积/μl 模板DNA 10-50ng 2 水 14.8 10×PCR缓冲液（不含MgCl2） 1× 2.5 MgCl2溶液 2mmol/L 2.0 dNTP溶液 0.4mmol/L 1.0 正向引物 0.5 μmol/L 1.25 反向引物 0.5 μmol/L 1.25 Taq酶（5IU/ml） 1IU 0.2 PCR扩增 预变性 10min，95℃ 20s， 95℃ 扩增 40s， 64℃ 40s， 72℃ 循环数 40 最终延伸 3min， 72℃ 电泳及结果分析 方法：取PCR产物在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶上进行电泳，用紫外灯或凝胶成像系统观察并记录PCR产物电泳条带。 结果： 阴性：无电泳条带 阳性：有电泳条带 待测样品 有电泳条带：含转基因成分 无电泳条带：不含转基因成分 170bp M 1 2 3 4 原理 特异性强、自动化程度高、不使用溴化乙锭、不污染环境等特点 指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线（标准品）对未知模板进行定量分析的方法。 使用的化学物质：荧光探针和荧光染料 实时荧光定量PCR TaqMan荧光探针 PCR扩增时，加入一对引物，同时加入一个特异性的荧光探针。 该探针为一寡核苷酸，两端分别标记了一个报告荧光基团和一个猝灭荧光基团。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被猝灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和猝灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 TaqMan探针法原理图 荧光扩增曲线的三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期） ，荧光信号指数扩增阶段（对数期）、平台期。 只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，所以选择在这个阶段进行定量分析。 为了定量和比较的方便，引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和Ct值 PCR的定量方法 荧光域值（threshold） 是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上 理论上，第3-15个循环的荧光值作为baseline，这段区域荧光标准偏差的三倍就是threshold。 手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段 Ct （Cycle threshold）值 是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。 PCR的定量方法 反映PCR循环次数和荧光强度的曲线 Ct值与起始模板的关系： 模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系