电泳的概念.ppt

8.2考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue，简称CBB)染色： 在蛋白质染色中，目前考马斯亮蓝染色法最为常用，1965年考马斯亮蓝应用于聚丙烯酰胺凝胶染色，它步骤简便、灵敏度较高，可进行定量扫描。它可分为R和G型两类： R型为三苯基甲烷(triphenylmethane)，每个分子含有两个SO3H基团，本身偏酸性，磺酸基与蛋白质的碱性基团结合形成染料—蛋白质复合物。 G型为二甲花青亮蓝(xylene cyanine brilliant blue)，是一种甲基取代的三苯基甲烷。 R-250 G-250 SO3Na 考马斯亮蓝R-250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合，尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内（15—20 ?g），扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。 考马斯亮蓝G-250染色灵敏度不如R-250，其优点是在三氯乙酸中以胶体形式存在，能选择性地和蛋白质形成复合物，染色迅速，着色深的蛋白质区带在数秒内即可显现出来，约45分钟后着色最深，本底低，重复性好，适用于定量分析。 8.3荧光染料： 是一种在电泳前用荧光分子将蛋白质共价偶联标记，于电泳后通过扫描来测定荧光区带的方法，但由于荧光标记蛋白质的定量需要特殊的扫描装置，影响了此方法的广泛应用。研究工作中使用的荧光染料有以下几种： (1)磺酰氯(2,5-二甲氨基萘磺酰，dansyl chloride，简称DNS-Cl)：是最早应用的荧光染料，它在碱性条件下与氨基酸、肽、蛋白质末端氨基酸发生反应，使它们获得荧光性质，在280nm和320nm波长的紫外灯下可观察到电泳条带。 (2)荧光胺(fluorescamine，又称fluram)：作用与丹磺酰氯相似。在碱性条件下与氨基酸、肽、蛋白质末端氨基酸发生反应，产生荧光。其优点是由于自身及分解产物均不显示荧光，标记的蛋白质是唯一的荧光物质，因此，凝胶没有荧光背景。 (3)2-甲氧基-2,4-二苯基-3-呋喃酮[2-methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanone，简称MDPF]：其作用与丹磺酰氯和荧光胺相似，其优点是凝胶上MDPF标记蛋白质的荧光可保持数月。用MDPF标记时，荧光强度在蛋白质浓度1—500ng范围内呈线性关系，标记蛋白做SDS分析时，其相对分子质量的对数(log10)与相对迁移率之间呈线性关系。 (4)1-苯胺基-8-萘磺酸(1-amino-naphthal-sulfonic acid，简称ANS)：染料本身无色，但与蛋白质结合后，在紫外光下可显出黄绿色荧光。电泳后将凝胶置于此染料溶液中，1—3分钟后在长波紫外光下即可观察到荧光蛋白条带。 8.4硝酸银染色： 目前染色机理尚不清楚，可能是将结合在蛋白质上的银离子还原成金属银而显色，研究表明蛋白质上碱性和含硫氨基酸在银染中的重要性，染色灵敏度是考马斯亮蓝R-250的100倍左右，可以检测0.38ng /mm2的牛血清白蛋白。银染显色的方法大致可以分化学显色和光显色两类。 (1)化学显色法(chemical development)：又分为双胺银染法(diamine silver stains)和非双胺银染法(non-diamine silver stains)。 双胺法是用碱性的NH4OH形成银—双胺复合物，固定后的凝胶浸泡在此溶液中，通过酸化（通常用柠檬酸）显像，使用较广泛。 非双胺法是将固定的凝胶置于酸性的硝酸银溶液中，银离子与蛋白质发生作用，在碱性条件下，用甲醛将银离子还原为金属银而显像，用酸性溶液（柠檬酸或醋酸）终止显色反应，用碳酸钠处理凝胶可进一步增强银染色的强度。非双胺法的灵敏度较双胺法高10倍。 (2)光显色(photo development)：显色反应是固定后的凝胶在酸性环境中用光能将银离子还原成金属银而使蛋白条带显色，它的优点是操作程序简单，使用一种染色溶液即可达到显色目的。 8.5特殊蛋白质染色: (1)糖蛋白染色：糖蛋白可以通过对蛋白或碳水化合物的染色来检测。如与糖链的反应，用过碘酸-Schiff试剂(periodic-Schiff’s reagent)染色，简称PAS染色，显色结果在543nm处可观测到颜色。检测灵敏度，最高可以达到40 ng糖蛋白。 (2)脂蛋白染色：脂蛋白可以用常规的染色方法，苏丹黑B(sudan black)是常用的染料，银染法仍然是最灵敏的方法。近年有报道一种双染